Nosso protocolo descreve o uso de corantes BODIPY convencionais para microscopia de super-resolução usando seus estados esparsos e vermelhos. Isso nos permite estudar organelas e biomoléculas em células vivas com resolução de 30 nanômetros. A vantagem deste método é sua simplicidade e a versatilidade de diferentes conjugados BODIPY disponíveis que fornecem uma fonte duradoura de sinais de molécula única.
Nossa aplicação demonstrada pode se tornar importante para obter insights sobre doenças como doença hepática gordurosa ou diabetes tipo 2, resolvendo gotículas lipídicas e ácidos graxos abaixo do limite de difração. Nós ganhamos insights em ácido graxo e biologia de gotículas lipídicas em células de levedura e mamíferos. No entanto, essa técnica é aplicável a todos os outros tipos de células transparentes com baixa fluorescência de fundo.
Ao usar o técnico pela primeira vez, certifique-se de otimizar as concentrações di e os poderes laser, para observar sinais de molécula única brilhante. Uma demonstração visual deste técnico é importante para ver como a concentração di e otimização da potência laser resulta em sinais brilhantes de molécula única. Mantenha as células U2OS mamianas em DMBM não fluorescentes com soro bovino 10% bovino 4 milimolar glutamina, um piruato de sódio milimolar, e um por cento de antibióticos de estreptomicina de penicilina em um frasco T-25.
Divida as células em 70 a 80% de confluência para um a cinco, e pipeta em um único poço de uma placa de oito poços. Altere as células na placa de oito poços por 12 a 24 horas. Dez minutos antes de imagens, adicione um bodipy-C12 Lysotracker verde ou o outro conjugado BODIPY, adicione uma concentração final de 100 nanomolar.
Monte os conjuntos de filtros apropriados no caminho de emissão com base na cor de emissão do BODIPY que está sendo utilizado. Ligue o microscópio. Estágio do microscópio, 488 nanômetros e lasers de 561 nanômetros, assim como a câmera.
Adicione uma gota de óleo emergente no objetivo do microscópio. Abra o software HAL4000 que controla a luz LED para imagens de campo brilhante, poderes de laser, persianas a laser e configurações de câmera para imagens. Defina o ganho do EMCCD para 30 e a temperatura da câmera para menos 68 graus Celsius.
Prepare a câmera e o software correspondente para gravar filmes em 20 Hertz. Ligue o aquecedor do estágio do microscópio e coloque-o em temperatura de 37 graus celsius e a um nível de dióxido de carbono de 5%. Ajuste a cor de correção objetiva de acordo.
Monte a amostra no estágio do microscópio e concentre-se até que o sistema de foco se envolva. Mova o estágio usando o controlador de palco até que as células saudáveis apareçam no campo de visão. Carregue sequências de obturadores laser para a excitação de monumus, bem como dimmers, a quem a potência laser do laser de 561 nanômetros para entre 821 quilowatts por centímetro quadrado para uma microscopia de localização de uma única molécula, de tal forma que, poros de fluorescência de molécula única são detectados no canal de emissão deslocada para o vermelho.
Ajuste a potência do laser entre o ponto 035 e o ponto 07 watts por centímetro quadrado para o laser de 488 nanômetros, de modo que a fluorescência convencional apareça no canal de emissão verde. Escolha uma pasta de destino para filmes e grave quadros de aquisição de 5000 a 20000 para coletar localizações suficientes para reconstruir imagens de super resolução. Mova-se para diferentes campos de visão e repita para coletar dados para mais células.
Carregue o filme em um único software de análise de microscopia de localização de moléculas. Visualmente tela o filme e ajustar configurações de contraste, de modo que uma única molécula fluorescente piscando é visível. Para definir parâmetros de identificação de moléculas únicas para a montagem do gaussiano 2D, PSFs.
Visualmente tela através de alguns quadros de exemplo para verificar os parâmetros de identificação, e detectar de forma confiável as distintas rajadas fluorescentes de molécula única. Análise de imprensa para realizar microscopia de localização de moléculas únicas imagine a análise com os parâmetros de identificação otimizados. E então, torne cada molécula como um gaussiano 2D cuja largura é ponderada pela raiz quadrada inversa do número detectado de fótons.
Avalie a qualidade dos dados. Use faixas de quadros restritas para observar distribuições de moléculas únicas em instâncias e tempo mais específicos. Isso explica a movimentação de organelas durante a aquisição de dados.
Neste estudo, apresentamos um procedimento otimizado de preparação da amostra, aquisição e análise de dados com microscopia de localização de molécula única utilizando conjugados BODIPY. Para demonstrar um exemplo do fluxo de trabalho para aquisição e análise de dados de microscopia de localização de moléculas únicas, o BODIPY na levedura foi empregado para resolver gotículas lipídicas abaixo do limite de difração óptica. Exemplos dos diferentes modos de imagem multicoloridos do BODIPY em conjugação com outras sondas como GFP e mEos2 são mostrados aqui.
BODIPY-C12 formou-se em aglomerados móveis de gotículas não lipídicas na periferia celular após o jejum, em contraste com sua incorporação em gotículas lipídicas sob condições alimentadas. Para estender ainda mais a capacidade de microscopia de localização de moléculas únicas de conjugados BODIPY para células mamíferas, BODIPY-C12 e Lysotracker verde em células U2OS vivas foram imagens. Otimizar a concentração do BODIPY, bem como excitar os poderes de laser são passos críticos para visualizar sinais brilhantes de molécula única e reconstruir imagens de super resolução.
Este método pode ser usado com qualquer outro conjugado BODIPY para obter uma visão de alta resolução, na distribuição temporal especial de bio-moléculas específicas dentro de células vivas. Nossa técnica abriu caminho.para interrogar ainda mais a gotícula lipídica e a biologia dos ácidos graxos na escala das lentes nanoscópicas. No entanto, esta aplicação vai muito além dos filopectetes específicos devido à disponibilidade de vários conjugados BODIPY funcionais.
Por favor, não deixe de seguir os procedimentos operacionais padrão para o manuseio das amostras biológicas e corantes, e também ser nossos hedgers obrigados e seguir os procedimentos de segurança a laser.
