我々のプロトコルは、そのまばらな、赤シフト状態を使用して超解像顕微鏡のための従来のBODIPY染料の使用を記述する。これにより、30ナノメートルの分解能で生きている細胞のオルガネラや生体分子を研究することができます。この方法の利点は、そのシンプルさと、単一分子信号の長期的なソースを提供する異なる利用可能なBODIPYコンジュゲートの汎用性です。
我々の実証されたアプリケーションは、脂肪肝疾患や2型糖尿病などの疾患の洞察を得るために重要になる可能性があり、脂質滴と脂肪酸を回折限界以下に解決することによって。酵母細胞や哺乳動物細胞における脂肪酸・脂質滴の生物学の知見を得る。しかし、この技術は、低バックグラウンド蛍光を有する他のすべての透明細胞タイプに適用可能である。
初めて技術を使用する場合は、明るい単一分子信号を観察するために、di濃度とレーザーパワーを最適化することを確認してください。この技術の視覚的なデモンストレーションは、レーザーパワーのdi濃度と最適化が明るい単一分子信号をもたらす方法を見るために重要です。T-25フラスコでは、10%の胎児ウシ血清4ミリモルグルタミン、1ミリモルナトリウムピルビン酸、1%ペニシリンストレプトマイシン抗生物質を用いて、非蛍光性DMBMの哺乳類U2OS細胞を維持する。
70~80%の合流度で細胞を1~5個に分割し、ピペットを8つのウェルプレートの単一ウェルに分割します。8つのウェルプレートの細胞を12〜24時間変えます。それをイメージングする10分前に、BODIPY-C12ライソトラッカーグリーンまたは他のBODIPYコンジュゲートを追加し、100ナノモルの最終濃度を追加します。
使用されている BODIPY の放出色に基づいて、適切なフィルタ セットをエミッション パスにマウントします。顕微鏡の電源を入れます。顕微鏡ステージ、488ナノメートルおよび561ナノメートルレーザー、ならびにカメラ。
顕微鏡の目的に新興油の滴を加える。明視野イメージング、レーザーパワー、レーザーシャッター、イメージング用カメラ設定のLEDライトを制御するHAL4000ソフトウェアを開きます。EMCCD ゲインを 30 に、カメラ温度をマイナス 68°C に設定します。
20ヘルツで映画を録画するためにカメラと対応するソフトウェアを準備します。顕微鏡ステージヒーターをオンにし、摂氏37度の温度と5%の二酸化炭素レベルに設定します。目的の補正色を適宜調整します。
サンプルを顕微鏡ステージに取り付け、フォーカスシステムがかみ合うまで焦点を合わせます。正常なセルが視野に表示されるまで、ステージコントローラーを使用してステージを移動します。モナムスの励起のためのレーザーシャッターシーケンスと調光器、1分子局在化顕微鏡の561ナノメートルレーザーのレーザーパワーが1平方センチメートル当たり821キロワットの間で、赤シフト発光チャネルで単一分子蛍光孔が検出されるような負荷レーザーシャッターシーケンス。
488ナノメートルレーザーのポイント035とポイント07ワット/平方センチメートルの間のレーザーパワーを調整して、従来の蛍光が緑色の発光チャネルに現れるようにします。映画の保存先フォルダを選択し、5000 ~20000 の取得フレームを記録して、スーパー解像度のイメージを再構築するのに十分なローカリゼーションを収集します。別の視野に移動し、より多くのセルのデータを収集するために繰り返します。
ムービーを単一分子の局在顕微鏡分析ソフトウェアにロードします。単一分子蛍光点滅が見えるように、映像を視覚的にスクリーニングし、コントラスト設定を調整する。2Dガウス、PSFをフィッティングするための単一分子同定パラメータを設定する。
いくつかの例のフレームを視覚的にスクリーニングして識別パラメータを確認し、明確な単一分子蛍光バーストを確実に検出します。単一分子局在化顕微鏡を実行するために、分析を行うプレス分析は、最適化された同定パラメータを使用して分析を想像します。そして、検出されたフォトン数の逆平方根によって幅が重み付けされた2Dガウスとして、各分子をレンダリングします。
データの品質を評価します。制限されたフレーム範囲を使用して、より特定のインスタンスと時間で単一分子分布を観察します。これは、データ取得中のオルガネラの動きを説明します。
本研究では、BODIPYコンジュゲートを用いた単一分子局在化顕微鏡による最適化されたサンプル調製、データ取得および分析手順を発表した。単一分子局在化顕微鏡データを取得および分析するためのワークフローの一例を示すために、酵母におけるBODIPYは、光学回折限界以下の脂質滴を解決するために採用した。GFPやmEos2などの他のプローブとの結合におけるBODIPYの異なる多色イメージングモードの例をここに示す。
断食時に細胞周辺の移動性非脂質滴クラスターで形成されたBODIPY-C12は、供給された条件下で脂質液滴に組み込まれるのとは対照的である。さらに、BODIPYコンジュゲートの単一分子局在化顕微鏡機能を哺乳動物細胞に拡張するために、生きたU2OS細胞におけるBODIPY-C12およびライソトラッカーグリーンを画像化した。明るい単一分子信号を可視化し、超解像度画像を再構築するために、BODIPY濃度を最適化するだけでなく、レーザーパワーを刺激することは重要なステップです。
この方法は、他のBODIPYコンジュゲートと共に使用して、生きている細胞内の特定の生体分子の特殊な時間的分布において、高解像度の洞察を得ることができます。私たちの技術は、ナノスコピックレンズスケールで脂質滴と脂肪酸生物学をさらに尋問する道を開きました。しかし、このアプリケーションは、様々な機能的なBODIPYコンジュゲートの可用性のために、特定のフィロペステテをはるかに超えています。
生物学的サンプルおよび染料を取り扱うための標準的な操作手順に従い、また当社の義務的なヘッジ者であり、レーザー安全手順に従ってください。
