Il nostro protocollo descrive l'uso di coloranti BODIPY convenzionali per microscopia a super risoluzione utilizzando i loro stati radi e spostati verso il rosso. Questo ci permette di studiare organelli e biomolecole in cellule viventi con risoluzione di 30 nanometri. Il vantaggio di questo metodo è la sua semplicità e la versatilità dei diversi coniugati BODIPY disponibili che forniscono una fonte duratura di segnali a singola molecola.
La nostra applicazione dimostrata potrebbe diventare importante per ottenere informazioni su malattie come la malattia del fegato grasso o il diabete di tipo 2 risolvendo goccioline lipidiche e acidi grassi al di sotto del limite di diffrazione. Otteniamo informazioni sulla biologia degli acidi grassi e delle goccioline lipidiche nel lievito e nelle cellule di mammiferi. Tuttavia, questa tecnica è applicabile a tutti gli altri tipi di cellule trasparenti con bassa fluorescenza di fondo.
Quando si utilizza la tecnica per la prima volta, assicurarsi di ottimizzare le concentrazioni e i poteri laser, per osservare segnali luminosi a singola molecola. Una dimostrazione visiva di questa tecnica è importante per vedere come la di concentrazione e l'ottimizzazione della potenza laser si traduce in segnali luminosi a singola molecola. Mantenere le cellule U2OS dei mammiferi in DMBM non fluorescente con siero bovino 10%fetale quattro glutammina millimolare, un piruvato di sodio millimolare e un per cento di antibiotici streptomicina penicillina in un pallone T-25.
Dividere le celle dal 70 all'80% di confluenza a uno a cinque e pipettare in un unico pozzo di una piastra di otto pozza. Alterare le cellule nella piastra dell'otto pozzi per 12-24 ore. Dieci minuti prima di immaginirlo, aggiungere un Lysotracker verde BODIPY-C12 o e l'altro coniugato BODIPY, aggiungere una concentrazione finale di 100 nanomolari.
Montare i set di filtri appropriati nel percorso di emissione in base al colore di emissione di BODIPY utilizzato. Accendi il microscopio. Stadio del microscopio, laser da 488 nanometri e 561 nanometri, così come la fotocamera.
Aggiungi una goccia di olio emergente all'obiettivo del microscopio. Aprire il software HAL4000 che controlla la luce LED per l'imaging a campo luminoso, le potenze laser, le persiane laser e le impostazioni della fotocamera per l'imaging. Impostare il guadagno EMCCD su 30 e la temperatura della fotocamera a meno 68 gradi Celsius.
Prepara la fotocamera e il software corrispondente per registrare film a 20 Hertz. Accendere il riscaldatore a stadio del microscopio e impostarlo a una temperatura di 37 gradi Celsius e a un livello di anidride carbonica del cinque percento. Regolare di conseguenza il colore della correzione oggettiva.
Montare il campione sullo stadio del microscopio e mettere a fuoco fino a quando il sistema di messa a fuoco non si attiva. Spostare lo stage utilizzando il controller di fase fino a visualizzare le celle integre nel campo visivo. Caricare sequenze di otturatore laser per l'eccitazione di monumo e dimmer, ai quali viene rilevata la potenza laser del laser da 561 nanometri a 821 kilowatt per centimetro quadrato per una microscopia di localizzazione a singola molecola, in modo tale che i pori a fluorescenza a singola molecola vengono rilevati nel canale di emissione spostato verso il rosso.
Regolare la potenza laser tra il punto 035 e il punto 07 watt per centimetro quadrato per il laser da 488 nanometri, in modo che la fluorescenza convenzionale appaia nel canale di emissione verde. Scegli una cartella di destinazione per i filmati e registra da 5000 a 20000 fotogrammi di acquisizione per raccogliere abbastanza localizzazioni per ricostruire immagini con super risoluzione. Passare a diversi campi di visualizzazione e ripetere per raccogliere dati per più celle.
Caricare il filmato in un software di analisi della microscopia a localizzazione di una singola molecola. Scherma visivamente il filmato e regola le impostazioni di contrasto, in modo che sia visibile il lampeggiamento fluorescente a singola molecola. Per impostare parametri di identificazione di singole molecole per il montaggio del gaussiano 2D, I FPF.
Scherma visivamente alcuni fotogrammi di esempio per controllare i parametri di identificazione e rilevare in modo affidabile i distinti burst fluorescenti a singola molecola. L'analisi della stampa per eseguire la microscopia di localizzazione a singola molecola immagina l'analisi con i parametri di identificazione ottimizzati. E poi, rendere ogni singola molecola come un gaussiano 2D la cui larghezza è ponderata dalla radice quadrata inversa del numero rilevato di fotoni.
Valutare la qualità dei dati. Utilizzare intervalli di fotogrammi limitati per osservare distribuzioni di singole molecole in istanze e tempi più specifici. Ciò spiega il movimento degli organelli durante l'acquisizione dei dati.
In questo studio, abbiamo presentato una procedura ottimizzata di preparazione, acquisizione e analisi dei dati con microscopia di localizzazione a singola molecola utilizzando coniugati BODIPY. Per dimostrare un esempio del flusso di lavoro per l'acquisizione e l'analisi dei dati della microscopia di localizzazione a singola molecola, BODIPY nel lievito è stato impiegato per risolvere goccioline lipidiche al di sotto del limite di diffrazione ottica. Esempi delle diverse modalità di imaging multicolore di BODIPY in coniugazione con altre sonde come GFP e mEos2 sono mostrati qui.
BODIPY-C12 si è formato in ammassi mobili di goccioline non lipidiche nella periferia cellulare al momento del digiuno, in contrasto con la loro incorporazione nelle goccioline lipidiche in condizioni alimentate. Per estendere ulteriormente la capacità di microscopia di localizzazione a singola molecola dei coniugati BODIPY alle cellule di mammifero, sono stati imageati BODIPY-C12 e Lysotracker green nelle cellule U2OS vive. L'ottimizzazione della concentrazione bodipy e l'eccitantità dei poteri laser sono passaggi critici per visualizzare segnali luminosi a singola molecola e per ricostruire immagini a super risoluzione.
Questo metodo può essere utilizzato con qualsiasi altro coniugato BODIPY per ottenere informazioni ad alta risoluzione, nella speciale distribuzione temporale di specifiche bio-molecole all'interno di cellule viventi. La nostra tecnica ha spianato la strada, per interrogare ulteriormente la goccioline lipidica e la biologia degli acidi grassi sulla scala delle lenti nanoscopiche. Tuttavia, questa applicazione va ben oltre i filopecteti specifici a causa della disponibilità di vari coniugati BODIPY funzionali.
Assicurati di seguire le procedure operative standard per la gestione dei campioni biologici e dei coloranti, non solo di essere i nostri siepi obbligati e seguire le procedure di sicurezza laser.
