نشكر ب. فيريجزر، ج. يوهانسن ه. ، أوخورا على الأجسام المضادة وألف ديبيك، ومراكز بلومينغتون وفيينا للأسهم للذباب. بفضل جاكسون جيم للاقتراحات وتحفيز المناقشات.

1. مجموعة الخصية دروسوفيلا
ملاحظة: الذكور الصغار (0-15 ساعة بعد انهيار الدماغ) ضرورية لفحص الخلايا الجرثومية ثنائية الديبلويد (أي الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية).
<ol><li>حدد الذباب الصغير قدر الإمكان لتقليل التداخل من تطوير الحيوانات المنوية.</li>
	<li>تخدير الذباب عن طريق التعرض القصير لثاني أكسيد الكربون ونقلها إلى منصة ذبابة14،15.</li>
	<li>تحت المجهر تشريح (10x التكبير)، واستخدام ملقط لإزالة الرأس.</li>
	<li>نقل 5 إلى 10 الذباب مقطوعة الرأس إلى 100 ميكرولتر من العازلة رينغر (183 MM KCI، 47 mM NaCl، 10 mM تريس-HCI، 1 mM EDTA، مثبط البروتين الكامل، درجة الحموضة 6.8) على شريحة زجاجية مغلفة بالسيليكون على دعم الخلفية السوداء.</li>
	<li>مع تشريح المجهر في التكبير 40x، استخدم زوج واحد من ملقط رقم 5 لعقد ذبابة بين الصدر والبطن، ومع ملقط أخرى، وسحب البطن بعيدا عن الصدر. عزل بسرعة الخصيتين والأنسجة المجاورة من جثة ذبابة15 ومكان في قطرة جديدة من العازلة رينغر على نفس الشريحة.</li>
	<li>مرة واحدة جميع الخصيتين جاهزة، وتنظيف الخصيتين من الأنسجة المتبقية (الغدة الملحقة والأعضاء التناسلية الخارجية).</li>
	<li>إزالة المخزن المؤقت الزائد من الإفلات الذي يحتوي على الخصية تشريح. عادة، استخدم ماصة P200 مع طرف 10 ميكرولتر مزودة على رأس طرف 200 ميكرولتر. وهذا يسمح بإزالة الفائض السائل من خلال فتحة صغيرة. ضع قطرة من 4٪ مثبت بارافورمالديهايد على رأس القطرة التي تحتوي على الخصيتات المشرحة، ثم قم بنقل الخصية بسرعة إلى أنبوب يحتوي على محلول مثبت جديد.</li>
</ol>2. تثبيت بارافورمالدهيد
<ol><li>إعداد 2 مل من محلول التثبيت قبل الاستخدام مباشرة: 600 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد مخففة في ملحي الفوسفات المخزنة (PBS) مع 30 ميكرولتر من NP40 20٪ بالإضافة إلى 1200 ميكرولتر من الهيبتان في أنبوب طرد مركزي ميكروني سيليكون 2 مل. استخدام 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني أعدت في 600 ميكرولتر aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية. تحذير: الهيبتان والبارافورمالديهيد سامان ويجب التعامل معهما في غطاء الدخان. التصرف فيها وفقا للوائح المعهد المضيف.</li>
	<li>نقل الخصيتين باستخدام p200 ميكروبايت مع طرف فتحة واسعة إلى حل PFA/NP40/heptane. يهز أنبوب صعودا وهبوطا لمدة 30 ثانية باليد. مواصلة تحديد الخصية على خلاط دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>وقف خلاط دوارة ووضع أنبوب في رف أنبوب للسماح فصل المرحلة والخصيات لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب.</li>
	<li>إزالة جميع heptane والحل المثبت وشطف الخصيتان بسرعة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x.</li>
	<li>نقل إلى أنبوب 200 μL الفردية نظيفة. إجراء جميع الحضانات في هذه الأنابيب الصغيرة لتقليل كميات الأجسام المضادة المستخدمة.</li>
	<li>إزالة المخزن المؤقت الزائد باستخدام ميكروبايت 200 ميكرولتر مع كل من P200 وطرف P10 المرفقة. الحرص على عدم تستنشق الخصية.</li>
	<li>إبقاء الخصيتين في برنامج تلفزيوني 1x على الجليد حتى جميع العينات جاهزة.</li>
</ol>3. تلطيخ الأجسام المضادة في الحل
<ol><li>تجاهل برنامج تلفزيوني وترك الخصيتين في 0.3٪ PBS-T لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ل permeabilize أغشية الخلايا.</li>
	<li>قبل الحضانة في نفس العازلة بالإضافة إلى 5٪ مصل الماعز العادي (NGS) لمدة 1 ساعة.</li>
	<li>إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في 0.3٪ PBS-T بالإضافة إلى 5٪ NGS(جدول المواد).</li>
	<li>احتضان الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية (أو درجة حرارة الغرفة) مع التحريض لطيف على الروك.</li>
	<li>غسل 3 مرات في 0.3٪ PBS-T لمدة 15 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة. السماح للخصيات لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الجاذبية.</li>
	<li>إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة 1:500 من سلسلة DyLight المترافقة.</li>
	<li>احتضان الأجسام المضادة الثانوية في غرفة مظلمة لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>غسل في 0.3٪ PBS-T لمدة 15 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة. ثم كرر مع 0.2٪ PBS-T و 0.1٪ PBS-T، في كل مرة لمدة 30 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة. قم بغسل نهائي في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 30 دقيقة لإزالة المنظفات.</li>
	<li>إضافة 180 ميكرولتر من حل DAPI في 1 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 15 دقيقة. حل الأسهم هو 10 ملغ / مل في H2O. تجنب صنع حل الأسهم في برنامج تلفزيوني، والتي يمكن أن تقلل من إشارة تلطيخ DAPI على الكروماتين المنتشر في الحيوانات المنوية أكبر.</li>
	<li>يغسل 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما.</li>
	<li>استخدم قلم حاجز مسعور لرسم دائرة على شريحة نظيفة.</li>
	<li>يستنشق الخصية ووضعها على الشريحة. قبل الشطف تلميح فتحة واسعة مع 0.1٪ PBS-T يمنع الخصيتين من التمسك تلميح. إزالة برنامج تلفزيوني الزائدة.</li>
	<li>إضافة قطرة (حوالي 100 ميكرولتر) من سيتيفلور AF1.</li>
	<li>ضع غطاء زجاجيا برفق فوق الأنسجة، مع الحرص على تجنب محاصرة فقاعات الهواء.</li>
	<li>ختم غطاء على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر واضحة.</li>
	<li>مراقبة الشرائح على المجهر.</li>
</ol>4. تحليلات التكلس
<ol><li>الحصول على صور confocal. استخدمنا المجهر زايس LSM 710 confocal (63x خطة الزيت أبوكروماتيك) مع دقة z من 0.5 أو 1 ميكرومتر.</li>
	<li>حدد خلايا مختلفة من الخصية المستقلة.</li>
	<li>استيراد الصور إلى برامج المعالجة (مثل Imaris).</li>
	<li>تعريف النواة عن طريق تجزئة يدوية من أجل استبعاد النوى المجاورة. استخدام برنامج كولوك؛ فإنه يجمع معاملات الارتباط بيرسون (PCCs) داخل وحدة التخزين بأكملها بين 2 الفلوروفور.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells.">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li><li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinas-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 71-148 (1993).</li><li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program.">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li><li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation.">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li><li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells.">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li><li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAD1:+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms.">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).</li><li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores.">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li><li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+checkpoint+proteins+HsMAD1+and+HsMAD2+are+associated+with+nuclear+pore+complexes+in+interphase.">Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase.</a> Journal of Cell Science. 114, 953-963 (2001).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila.">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li><li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development.">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641 (2011).</li><li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup154,+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene.">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li><li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling.">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li><li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells.">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue,+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis.">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), 1273-1275 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), 102-104 (2012).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis.">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li><li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis.">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li><li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation.">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li><li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes.">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

يوفر هذا البروتوكول طريقة للتكبيل المناعي الناجح لخصيات Drosophila البالغة الكاملة التركيب. كما ورد في إجراءات أخرى يجب استخدام الذكور الصغار (حتى أننا قصرنا العمر إلى أقل من 20 ساعة بعد الانفجار) لتقليل وجود الحيوانات المنوية النامية، مما يهدد بعرقلة الحيوانات المنوية. يجب أن يكون التشريح سري...

إن الخصيتان Drosophila نموذج قيم لدراسة البنية النووية. في الخلايا المنوية ميتوتيك، وتحتل إلى حد كبير الحجم النووي من الكروماتين. تخضع هذه الخلايا لأربع جولات من الانقسام ، مما ينتج كيسا من 16 خلية منوية أولية. على مدى الأيام القليلة القادمة ، تمر الخلايا المنوية عبر 6 مراحل نمو (S1-S6) ، وزيادة كبيرة في الحجم ، تقريبا 20 أضعاف1،2. كما أنها تغير مورفولوجيا النووية الخاصة بهم. الخطوط العريضة للنواة ، التي كشفت عنها صفح Dm0 ، يصبح غير منتظم ويظهر التغلغل العميق1،3. ويرافق ذلك تغييرات واسعة النطاق في التعبير الجيني والتعديلات في chromatin المنظمة1،4،5،6،7. الكروموسومات بين المراحل محددة جيدا في المرحلة S4-S5، وتشكيل ثلاثة كتل متميزة المقابلة لautsomes ثنائية التكافؤ الرئيسية 2 والزوج X-Y رست مع النيوكليولوس.
تم عزل Mad1 أصلا كعنصر رئيسي في نقطة التفتيش mitotic (استعرضت في8). في مرحلة ما بين المراحل، ويوصف بأنه يقع في المقام الأول في المغلف النووي ولكن أيضا في النيوكليوبلازم9،10،11. في اختبار Drosophila ، أبلغنا أن Mad1 بارز في النيوكليوبلازم ، ويرتبط ارتباطا وثيقا بكتلة الكروماتين الذاتية الرئيسية وإلى حد أقل مع الكروماتين XY. لقد حددنا هذا الهيكل المرتبط بالكروماتين على أنه MINT (الإقليم النووي الداخلي المحتوي على Mad1)12. وارتبطت أربعة بروتينات أخرى مع MINTs في الحيوانات المنوية: نوكليوبورين Mtor / Tpr، وS SUMO peptidase Ulp1، وبروتين نقطة تفتيش ميتوتيك Mad2 و وحدة فرعية من مجمع يشبه بوليكومب Raf212.
لإكمال وصف MINTs ، كنا بحاجة إلى استخدام الأجسام المضادة وواجهنا المشاكل التقنية التي تواجه بشكل عام مع التثبط المناعي في الخصية: نفاذية ضعيفة مما يؤدي إلى عدم توحيد كبير للتلطيخ في عمق الخصية ، خاصة في الخلايا المنوية الكبيرة. Sألغت الاستعدادات زيادة الوصول إلى الأجسام المضادة ولكن أدى إلى صور مضغوطة, تقييد التحليلات 3D, ومنع قياس الفلورية الكمية, بما في ذلك كولوكالينج. ويمكن أيضا معالجة مشكلة اختراق الأجسام المضادة من قبل عوامل permeabilizing مثل 0.3٪ Na deoxycholate13، ولكن هذا الإجراء لم يسفر في أيدينا عن نتائج قابلة للاستنساخ. ولأننا قمنا بالعديد من تجارب وضع العلامات المشتركة، فقد تطلعنا إلى تحسين بروتوكول التهيئة. أدى الجمع بين 1٪ NP40 بالإضافة إلى الهيبتان إلى المزيد من القابلية للاستنساخ ، خاصة في دراسة الخلايا المنوية الكبيرة.
هذا البروتوكول ينفذ التثبيت والتلوي المناعي للخصيات في التعليق، وتحسين جودة العينة، فضلا عن تعزيز استنساخ، وجعلها مناسبة للفحص المجهري confocal. استخدمنا البروتوكول لتحديد أفضل للعلاقات المكانية لبعض بروتينات المغلف النووي مع الهياكل النووية للخلايا المنوية الكبيرة. ستسمح هذه الطريقة بإجراء تحقيقات أفضل للتغيرات المصاحبة لتطور الخلايا المنوية ، على سبيل المثال التغيرات الهيكلية الديناميكية للنواة بما في ذلك الكروماتين والنوكليوبلازم والمسام النووية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Drosophila srains</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mad1-GFP</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mtor RNAi&#160;</td>
			<td style="width:129px;">VDRC</td>
			<td style="width:93px;">ID 110218</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Materials</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:277px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock solution must be prepared in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dumont # 5 Fine Forseps&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MBP Wide Bore Pipette Tips</td>
			<td style="width:129px;">Fisherbrand</td>
			<td>11917744</td>
			<td>Wide aperture tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#160;0.2 mL Individual Tube</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml micro centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T3531-200EA&#160;</td>
			<td>Siliconized 2ml tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citifluor AF1</td>
			<td style="width:129px;">Citifluor</td>
			<td>AF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dakopen&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">Z377821-1EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>NS02L-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 4%</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148-500G&#160;</td>
			<td>Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X&#160;; aliquot by 600 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>14190094</td>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T&#160;</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td></td>
			<td>PBS 1X&#160; containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100, for molecular biology,&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP booster</td>
			<td style="width:129px;">Chromotek</td>
			<td>gba488</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Mtor</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat anti-Nup62</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guinea-pig anti-Ulp1</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Rabbit anti-Raf2</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DyLight conjugated series&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,&#160; rabbit or rat) as second antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount drosophila testes for 3d confocal analysis of large spermatocytes

الخصيتان Drosophila هي نظام نموذج قوي لدراسة العمليات البيولوجية بما في ذلك بيولوجيا الخلايا الجذعية والهندسة المعمارية النووية وداء الميوس وتنمية الحيوانات المنوية. ومع ذلك ، غالبا ما يرتبط التهيئة المناعية لاختبار Drosophila بأكمله بعدم التوحيد الكبير للتلطيخ بسبب اختراق الأجسام المضادة. المستحضرات المسحقة فقط جزئيا التغلب على المشكلة لأنه يقلل من نوعية 3D من التحليلات. هنا، ونحن نصف بروتوكول كامل جبل باستخدام NP40 وهبتان أثناء التثبيت جنبا إلى جنب مع وضع التوسيل المناعي في وسائل الإعلام السائلة. فهو يحافظ على الحجم المناسب للتنظير المجهري البؤري جنبا إلى جنب مع وضع العلامات القابلة للاستنساخ والموثوق بها. نعرض أمثلة مختلفة على إعادة تشكيل النواة ثلاثية الأبعاد لنوى الخلايا المنوية من أقسام الكونفوجال. تسمح القابلية للاستنساخ داخل الخصيتين وبينهما بالقياس الكمي ثلاثي الأبعاد ومقارنة الفلورسينس بين الخلايا المفردة من الأنماط الجينية المختلفة. استخدمنا مكونات مختلفة من هيكل MINT داخل النووية (Mad1 التي تحتوي على الأراضي النووية) فضلا عن عنصرين المرتبطة مجمع المسام النووية لتوضيح هذا البروتوكول وتطبيقاته على أكبر خلايا الخصية، وs4-S5 الحيوانات المنوية.

العقبة الرئيسية للحصول على تلطيخ كافية من الخصيتين Drosophila هو penetrability محدودة من الأجسام المضادة، والتي تم حلها جزئيا باستخدام الاستعدادات سحقت ولكن على حساب الحث على تقييد التحليلات 3D (على سبيل المثال التمثيل 3D أو قياس الكولوكاليد). يسمح الإجراء وضع العلامات موحدة ويحافظ على حجم كافة خلايا ...

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes at JoVE.com

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

نقدم هنا بروتوكول محسن لإعداد التركيب الكامل والتلوي المناعي لخصيات دروسوفيلا ، ومناسبة للتنظير المجهري الكونفوكوكال ، كما تسمح بوضع علامات قابلة للاستنساخ وموثوق بها. نحن نوضح هذا البروتوكول من خلال التمثيل ثلاثي الأبعاد والتحديد الكمي لتجارب الكولوكاليشن على الخلايا المنوية الكبيرة S4-S5.

الالتصنت المناعي من الخصيتين Drosophila جبل كله لتحليل Confocal 3D من الحيوانات المنوية الكبيرة

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

immunostaining-whole-mount-drosophila-testes-for-3d-confocal-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

4.1K Views.  Université de Paris, F 75006, Paris, France. نقدم هنا بروتوكول محسن لإعداد التركيب الكامل والتلوي المناعي لخصيات دروسوفيلا ، ومناسبة للتنظير المجهري الكونفوكوكال ، كما تسمح بوضع علامات قابلة للاستنساخ وموثوق بها. نحن نوضح هذا البروتوكول من خلال التمثيل ثلاثي الأبعاد والتحديد الكمي لتجارب الكولوكا?...

Video: Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

طريقة لتلطيخ جسم الجامع في جبل الفرخ

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Immunostaining دفعي للكشف عن البروتين واسعة النطاق في الدماغ القرد الجامعة

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

كله يشن التحليل المناعى للالجنينية الاطراف الأوعية الدموية الجلدية : نظام نموذجي لدراسة الأوعية الدموية المتفرعة التشكل في الأجنة

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

عزلة ذبابة الفاكهة السوداء البطن الخصيات

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

جبل كله<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من E8.5 لأجنة الفئران E11.5

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

كله جبل RNA نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

تحليل الخلوي الحيوانات المنوية: الأعمال التحضيرية لايف والثابتة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخصية

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...