يوفر بروتوكولنا نهجًا فعالًا وقابلًا للتكرار لتقييم وقياس الأحداث البلعوية في الدمى. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا نستطيع قياس الأحداث البلمائية داخل هافوسيسات الفردية التي تسمح لنا بالكشف عن الاختلافات في العمليات البلعومية بين الأنماط الجينية في الذباب الفردي. يمكن أن يكون إجراء التشريح تحديًا ، لذلك عند تنفيذ هذه التقنية لأول مرة ، يمارس التشريح قدر الإمكان قبل إجراء الإجراء الكامل.
تبدأ من خلال إعداد الإبر الزجاجية للحقن. ملء حقنة ملليمتر واحد مع النفط المعدني، وإرفاق إبرة تحت الجلد قياس 30 المقدمة مع نانو حاقن. أدخل إبرة قياس 30 في الطرف الحاد من إبرة شعرية سحبت وملء مع النفط المعدني.
إزالة ببطء إبرة قياس 30 التأكد من أن يتم تشكيل أي فقاعات الهواء. إزالة كوليت ووضع خاتم O مختومة مع المسافة البادئة التي تواجه لأعلى. وضع أكبر O-حلقة على المكبس المعدنية، ثم إعادة ربط كوليت دون تشديد.
أدخل المكبس المعدني في الطرف الحاد من إبرة الزجاج المملوءة بالزيت وادفعها برفق إلى أسفل لإدخالها في حلقة O الأكبر. ثم تشديد كوليت حتى آمنة. بعد ملء الإبرة بالفلور أو الجسيمات الحساسة للحم ، قم بحقن الذباب في الصفيحة الصدرية.
الحقن ناجح إذا كانت الصبغة الخضراء تسير في الذبابة. وضع الذباب حقن في قارورة الغذاء الجديد مشيرا إلى الوقت الذي تم حقن الذبابة الأولى والأخيرة. وضع القارورة على جانبها حتى جميع الذباب قد تعافى لمنعهم من الحصول على عالقا في الغذاء.
توجيه الجانب البطني ذبابة حتى تحت تشريح stereomicroscope. ثم أدخل دبوس حشرة في الصدر وآخر من خلال الطرف الخلفي من البطن بالقرب من الأعضاء التناسلية. مرة واحدة وقد تم تثبيت جميع الذباب، واستخدام pipet نقل لإضافة وسائل الإعلام تشريح ما يكفي لتغطية الذباب.
إزالة الرأس مع مقص بشرة، وجعل شق أفقي مباشرة فوق دبوس الخلفي في البطن، ثم آخر في الطرف الأمامي من البطن. إجراء شق عمودي يربط بين الشقين الأفقيين الذي سيفتح تجويف البطن. استخدام ملقط لإزالة الأعضاء الداخلية والأنسجة، والتأكد من تجنب السفينة الظهرية.
إذا لزم الأمر، استخدم دبابيس إضافية لتأمين نهايات قطع من بشرة. ثم إزالة الصدر مع مقص بشرة. تجاهل وسائل الإعلام تشريح واستبدالها مع ملليلتر واحد من 4٪ PFA، وحماية تشريح من الضوء قدر الإمكان.
إصلاح التشريح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في حين هزاز في 20 دورة في الدقيقة. ثم إزالة المثبت وإضافة ملليلتر واحد من 1X PBST. إذا رغبت في ذلك، وصمة عار تشريح مع الأجسام المضادة.
بعد تركيب البشرة على شريحة المجهر، استخدم ملقط لتوجيه الجانب البطني لهم حتى، وتأكد من أن السفينة الظهرية مرئية. تم تقييم الذباب الصغير والذان لقدرة محددة على العمر على إجراء البلعمة عن طريق التصوير الفلوري لأوعية الدم على طول السفينة الظهرية. تم استخدام جسم مضاد ضد الميضور لضمان أن الخلايا فقط على طول السفينة الظهرية تم عدها.
وبما أن جزيئات الإشريكية القولونية المسماة بالفلورسنت هي ميكرومتر واحد في الطول والهيموسيات هي 10 ميكرومتر في القطر، تم حساب الأحداث الفلورية فقط داخل قطر 10 ميكرومتر تركزت على نواة إيجابية DAPI. ثم تم استخدام برنامج ImageJ لتحديد الأحداث. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم تصور أن الذبابة قد تم حقنها بالفعل وتذكر أن التوقيت أمر بالغ الأهمية.
إن استكمال الحقن والتشريح في الوقت المناسب سيساعد على تقليل الخطأ التجريبي والاختلافات المحتملة في معدل البلعوم. هذه التقنية سوف تسمح للباحثين لاستكشاف مجموعة متنوعة من المواضيع البحثية بما في ذلك الأسئلة المتعلقة المناعة الخلوية, مجموعات مختلفة من خلايا الدم أو التمييز بين البلعم الدم من إنتاج AMP خلال استجابة مناعية ناجحة.
