نشكر يسبر Kronhamn ودان Hultmark، مايكل Galko، ومركز بلومنغتون المالية للأسهم الطاير. شكر خاص إلى كورتني اونوديرا للحصول على المشورة مع التحليل الإحصائي. نشكر كاترينا الذهب لقراءة نقدية للمخطوطة، وكالبانا ماخيجاني، كاترينا الذهب، وأعضاء المختبر Derynck، وأعضاء المختبر Nystul للمناقشة والتعليقات على المخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من برنامج UCSF للبحوث الطبية الحيوية اختراق (PBBR)، مركز اسع، مؤسسة هيلمان، جمعية السرطان الأمريكية RSG DDC-122595، جمعية القلب الأمريكية 13BGIA13730001، المؤسسة الوطنية للعلوم 1326268، المعاهد الوطنية للصحة و1R01GM112083-01 1R56HL118726-01A1 (لKB).

1. كرية دموية التسييل / كشط الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الشرائح: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخيار 1 لالمجاهر بدون وظيفة مسح البلاط: للحصول على كل يرقة لتحليلها، وإعداد واحد شريحة زجاجية مع حوالي 5 آبار عنق الرحم من ركلة جزاء 2 مم الساحات لكل منهما، المقابلة لمنطقة المشاهدة مجال المجهر. إضافة حوالي 5-10 ميكرولتر من وسائل الإعلام S2 لكل (الشكل 1A). تبقي الشرائح في غرفة رطبة لمنع الآبار من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخيار 2 لالمجاهر مع وظيفة المسح الضوئي البلاط: للحصول على كل يرقة لتحليلها، وإعداد واحد شريحة زجاجية مع 3-4 الآبار عنق الرحم من ركلة جزاء ل~ 3-4 ملم الساحات لكل منهما؛ إضافة حوالي 15-20 ميكرولتر من S2 وسائل الإعلام إلى كل بئر (الشكل 1B). تبقي الشرائح في غرفة رطبة لمنع الآبار من الجفاف. ملاحظة: الرقم أعلاه الموصى بها من الآبار غير كافية لمجاميع تصل إلى 3000 hemocytes في يرقة (أواخر 2 الثانية الطور اليرقات، ~ 2،5-3 ملم طول، التحوير وصفها غالبية larvآل خلايا الدم). عند تقييم أرقام خلايا الدم أكبر، قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الآبار لتجنب الإفراط في الزحام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع اليرقات: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بخ الماء إلى قارورة تحتوي على ذبابة اليرقات واليرقات دافق في طبق بيتري، أو مغرفة بعض المواد الغذائية التي تحتوي على اليرقات في طبق بتري وتمييع مع الماء باستخدام زجاجة بخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار بلطف اليرقات من طبق بيتري باستخدام الفرشاة ووضعها في الماء في طبق تجويف أو على شريحة على كتلة الباردة. ملاحظة: يرقات يمكن الاحتفاظ به لفترة زمنية محدودة في الماء أو على كتلة الباردة. استخدام العينات في غضون 45 دقيقة أو أقل لتجنب موت اليرقات أو تأثيرات غير مرغوب فيها على hemocytes. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد اليرقات تحت المجهر مضان على كتلة المعدن البارد. قياس الأحجام وصورة يرقات إذا رغبت في ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل تعميم hemocytes (&quot;ينزف&quot;): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة ويتم اختيار اليرقات، ووضع يرقة واحدة في أول مسحة من ركلة جزاء أيضا (الشكل 1C،2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الإبر النظيفة أو 2 تشريح مقص وملقط لإجراء شق في كلا طرفي الخلفي والأمامي من اليرقة. لتجنب إزعاج hemocytes المقيمين، فمن الأفضل أن تجعل من هذه الشقوق على الجانب البطني من اليرقة. لنتائج متسقة، وجعل شقوق في نفس المواقع عن كل يرقة. ل1 شارع الطور اليرقات، 1 شق (في الجزء الأمامي بطني) كافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح يرقة ينزف لبضع ثوان من دون أي ضغط أو التحريض البدني (الشكل 2A). ملاحظة: إذا كنت تعمل على يرقات متعددة فمن الأفضل أن تجعل من هذه الشقوق لكل واحد قبل الانتقال إلى الخطوة التالية لتجنب الاحتفاظ اليرقات على الجليد وقتا طويلا مما قد يؤثر على سلامة العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع بلطف اليرقة مع الإبر أو ملقط وتراجع ذلك في البئر الثاني لشطف أي المتبقية hemocytes المتداولة. بعد ذلك، اتبع مع الافراج عن hemocytes المقيمين. </li></ol></li><lط&gt; عزل hemocytes المقيمين (&quot;كشط&quot;): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف نقل اليرقة إلى البئر المقبل (الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الغدة الليمفاوية لليرقة، والذي يقع عادة حوالي 1/3 من النهاية الأمامية لليرقة، والذي قد يتألق ظهريا من خلال جدار الجسم اليرقات. تجنب الغدة الليمفاوية في حين الإفراج عن hemocytes المقيمة التي تعلق أسفل اليرقة مع إبرة في أقرب وقت ممكن إلى الغدة الليمفاوية لتجنب ثقب (الشكل 2C). ملاحظة: خلال التطور الطبيعي تأخر نضوج الليمفاوية hemocytes الغدة مقارنة hemocytes اليرقات، وصحفيين فلوري من hemocytes متباينة قد لا تظهر إشارة في الغدة الليمفاوية من اليرقات الصغيرة. في هذه الحالات، يحتاج إلى عناية أقل لدفعها إلى الغدة الليمفاوية كما لا تلوث متباينة hemocytes اليرقات fluorescently المسمى من قبل hemocytes الغدة الليمفاوية من المتوقع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإفراج عن خلايا الدم المقيمين في dissectiفي عملية كشط و / أو لكز. استخدام التطريز واحد يعلقون على نحو فعال أسفل اليرقة بالقرب من الغدة الليمفاوية (انظر أعلاه) أو مناطق أخرى من الجسم حسب الحاجة. استخدام إبرة أخرى لضربة بالكوع في مجموعات من hemocytes التي هي واضحة من خلال جدار الجسم اليرقات (الشكل 2C، E)، والتي تهدف إلى فصل hemocytes. Hemocytes يمكن أيضا أن يطلق سراحه في حركة تجريف. ومع ذلك، وتمزيق للبشرة في وقت مبكر قد تفرج عن مجموعات كبيرة من خلايا الدم، التي يمكن أن تجعل العد الآلي أكثر تحديا. ملاحظة: اعتمادا على العمر وراثى لليرقة، فإن العدد الإجمالي للhemocytes تختلف. توزيع عملية الإفراج المذكورة أعلاه على مدى عدة آبار لتجنب الاكتظاظ في بعض الآبار مع خلايا الدم، التي يمكن أن تجعل واحد تحليل صورة الخلية أكثر صعوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لا تزال قليلة hemocytes في الذبيحة النهائية، عد هذه hemocytes عن طريق الملاحظة من خلال المجهر واستخدام رصيده عداد اليدوية (الشكل 2E). لتسهيل الفرز، صالدانتيل الذبيحة على منطقة نظيفة من نفس الشريحة ونشرها كما رقيقة ممكن لتقليل عدد الطائرات البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبمجرد أن تشريح كاملة، الانتظار بين 5-10 دقيقة للخلايا ليستقر (ولكن لا تلتزم بالضرورة) قبل التصوير الآبار. احتضان شريحة في غرفة رطبة لتجنب جفاف، وتجنب التعامل معها بخشونة من الشرائح، والتي يمكن أن تعكر صفو hemocytes تسويتها. ملاحظة: عند تحديد التهم كرية دموية، وخلايا سراح ليست ثابتة والخلايا يجب تصويرها بعد وقت قصير من التشريح، ويفضل أن يكون ذلك في غضون 30 دقيقة بعد الإفراج عن اليرقة. اعتمادا على حجم العقارات المتوسطة والخلية، فإن الغالبية العظمى من الخلايا قد استقروا داخل 5-10 دقائق، والتي ينبغي أن يتم تأكيد ذلك بالتركيز من خلال طائرات البصرية من المتوسط ​​في البئر. ومع ذلك، سوى جزء صغير من خلايا الدم انضمت إلى سطح الشريحة قبل هذا الوقت، وهذه حقيقة تحتاج إلى النظر فيها إذا تعديل هذا البروتوكول لapproache أساس تثبيت الخليةالصورة. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكمي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور لhemocytes استقر تحت المجهر فلوري (الشكل 2B، D، F). اتبع مع الكمي للhemocytes باستخدام برنامج يماغيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الصورة ليماغيج خوارزمية الفرز الخلية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة المفتوحة جيدا باستخدام يماغيج: ملف → → المفتوحة (تحديد موقع الملف وحدد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن صورة (ق) هو 8 بت أو 16 بت. ضبط عتبة للصورة عن طريق اختيار صورة ثم انقر فوق ضبط وحدد عتبة. مراقبة &quot;نافذة عتبة&quot; (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من &quot;الخلفية الداكنة&quot; الخيار. حدد &quot;الأحمر&quot; وزيادة مستوى عتبة أدنى (انظر السهم الأسود) حتى يتم وضع علامة كل خلية في الصورة مع نقطة حمراء (الخلايا التي لم يتم تغطيتها سيتبين في الرمادي؛ الشكل 3B). كما عتبة أدنىيتم زيادة بعض الخلايا سيصبح غير المراقب. هذا يمكن أن يكون مؤشرا لمدى لضبط عتبة أدنى. ملاحظة: أحيانا مجموعات من الخلايا لا يمكن حلها وسوف تحسب واحدا تلو العداد الجسيمات. في مثل هذه الحالات، وعدد الخلايا في كتلة يمكن تقدير عن طريق فحص صورة (تكبير إذا لزم الأمر) والعد والفرز اليدوي باستخدام عداد رصيده. بدلا من ذلك، عتبة أدنى يمكن زيادة لحل مجموعات من الخلايا. أي خلايا غير مميزة الناتجة عن هذا التلاعب ويمكن بعد ذلك أن تحسب باستخدام عداد رصيده. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل عدد الخلايا باستخدام يماغيج: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إطلاق محلل الجسيمات إلى عدد الخلايا (الشكل 3C). حدد تحليل وانقر على تحليل الجسيمات. اختياريا تحديد &quot;تراكب الخطوط العريضة&quot; لرؤية الجزيئات العد خوارزمية (الشكل 3D). بدلا من ذلك، وضع حد لحجم أو بكسل مجال وحدة (على سبيل المثال.، الخلية، كتلة من الخلايا، وما إلى ذلك) لخوارزمية لحساب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق موافق. مراقبة نافذة ملخص مع عدد (الشكل 3E). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. كرية دموية اضطراب الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لزعزعة hemocytes، حدد اليرقات ووضعها في أنبوب microcentrifuge 2 مل مع ما يقرب من 0.5 غرام من الخرز الزجاجي (212-600 ميكرون)، وإضافة 0.5 مل من الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة الأنبوب، من جهة، وبسرعة 10 لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد اليرقات من الخرز الزجاجي عن طريق إراقة محتويات أنبوب microcentrifuge في طبق بتري وفتنتقي اليرقات مع الفرشاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمرحلة الإنعاش، ووضع اليرقات في أطباق بتري معدة مسبقا مع كميات صغيرة من الطعام ذبابة. السماح لليرقات لإعادة تأسيس نمط كرية دموية لمدة تتراوح من 45 دقيقة أو كما تريد. ملاحظة: تخلصي من أي اليرقات التي توقفت عن الحركة، كما أنهم لقوا حتفهم في هذه العملية. ومع ذلك، فإننا نرى عادة لالضرر إيتل بعد 1 دقيقة من vortexing ل(انظر أدناه والتكميلي الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة النقاهة، مع الاستمرار في التسييل / كشط الفحص كما هو موضح أعلاه في القسم 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).</li><li>Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thicker+than+blood:+conserved+mechanisms+in+Drosophila+and+vertebrate+hematopoiesis.">Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis.</a> Dev Cell. 5, 673-690 (2003).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes:+masters+of+multitasking.">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).</li><li>Gold, K. S., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+the+two+myeloid+blood+cell+systems+in+vertebrates.">Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates.</a> Experimental hematology. 42, 717-727 (2014).</li><li>Makhijani, K., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+blood+cells+and+the+nervous+system:+Hematopoiesis+in+the+Drosophila+larva.">Of blood cells and the nervous system: Hematopoiesis in the Drosophila larva.</a> Fly. 6, 254-260 (2012).</li><li>Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+nervous+system+supports+blood+cell+homing+and+survival+in+the+Drosophila+larva.">The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva.</a> Development. 138, 5379-5391 (2011).</li><li>Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+hematopoiesis+in+Drosophila.">Postembryonic hematopoiesis in Drosophila.</a> Dev Biol. 230, 243-257 (2001).</li><li>Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W., Klapper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+origins+of+hemocytes+in+Drosophila.">The two origins of hemocytes in Drosophila.</a> Development. 130, 4955-4962 (2003).</li><li>Sieweke, M. H., Allen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+stem+cells:+self-renewal+of+differentiated+macrophages.">Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages.</a> Science. 342, 1242974 (2013).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature immunology. 14, 986-995 (2013).</li><li>Bretscher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nimrod+transmembrane+receptor+Eater+is+required+for+hemocyte+attachment+to+the+sessile+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster.</a> Biology Open. 1-9, (2015).</li><li>Leitao, A. B., Sucena, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+sessile+hemocyte+clusters+are+true+hematopoietic+tissues+that+regulate+larval+blood+cell+differentiation.">Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation.</a> eLife. , (2015).</li><li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4805-4809 (2009).</li><li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+blood+cells+function+as+a+surveillance+system+for+damaged+tissue+in+Drosophila+larvae.">Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 10017-10022 (2008).</li><li>Sinenko, S. A., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+Drosophila+tetraspanin,+Tsp68C,+suppresses+the+abnormal+proliferation+of+ytr-deficient+and+Ras/Raf-activated+hemocytes.">Increased expression of Drosophila tetraspanin, Tsp68C, suppresses the abnormal proliferation of ytr-deficient and Ras/Raf-activated hemocytes.</a> Oncogene. 23, 9120-9128 (2004).</li><li>Stramer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration.">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li><li>Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+hemocyte-specific+enhancer-reporter+transgenes+for+the+analysis+of+hematopoiesis+in+Drosophila+Genesis.">New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila Genesis.</a> 47, 771-774 (2009).</li><li>Gajewski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+crystal+cell-specific+enhancer+of+the+black+cells+prophenoloxidase+gene+in+Drosophila.">Identification of a crystal cell-specific enhancer of the black cells prophenoloxidase gene in Drosophila.</a> Genesis. 45, 200-207 (2007).</li><li>Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Drosophila+hematopoietic+lineage+by+conserved+transcription+factors.">Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors.</a> Science. 288, 146-149 (2000).</li><li>Zettervall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+directed+screen+for+genes+involved+in+Drosophila+blood+cell+activation.">A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 14192-14197 (2004).</li><li>Shim, J., Mukherjee, T., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+sensing+of+systemic+and+nutritional+signals+by+haematopoietic+progenitors+in+Drosophila.">Direct sensing of systemic and nutritional signals by haematopoietic progenitors in Drosophila.</a> Nature cell biology. 14, 394-400 (2012).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+blood+cell+development+in+the+animal+kingdom.">Blood cells and blood cell development in the animal kingdom.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هنا، نحن تصف الطريقة الأولى لاستعادة الكمية خلايا الدم المقيمين وتعميم من يرقات ذبابة الفاكهة واحدة، وتحديد هؤلاء السكان كرية دموية اثنين. ويضم البروتوكول الإفراج متتابعة من تعميم والمقيمين خلايا الدم، تليها التصوير والعد الآلي خلية. hemocytes المقيمين اليرقات يمكن تعبئتها عابر للتداول من قبل اضطراب الميكانيكية، وهي العملية التي من المعروف أن عكس إلى حد كبير في غضون 30-60 دقيقة فترة النقاهة 6. وبناء على ذلك، تم اختبار هذا البروتوكول بطريقتين، (1) عن طريق تقييم عدد كرية دموية الإجمالي لكل يرقة وجزء من تعميم hemocytes على مدى نمو اليرقات، و (2) من خلال طرد تجريبيا hemocytes المقيمين باستخدام أسلوب الآلي، والتي أكدت ارتباط ضيق التوطين كرية دموية وعدد كرية دموية في السكان المقيمين والمنتشرة. بالإضافة إلى ذلك، وقد تجلى استنساخ طريقة التي شاركmparing مجموعتين من البيانات من مكررات البيولوجية. في الماضي، استخدمت المختبرات مجموعة من التقنيات لقياس hemocytes اليرقات 6،13،21. هذا البروتوكول يحدد معيارا مشتركا لاسترداد وتحديد السكان خلايا الدم المقيمين وتعميم من يرقات ذبابة الفاكهة، وتوفير منصة للتكيف بسهولة. الطريقة الموصوفة أمر بالغ الأهمية للدراسات التي تركز على دور hemocytes المقيمين والمكروية بهم، والمكونة للدم جيوب 4-6، ومناسبة لدراسة ببروتين التي تحمل التحوير سلالات ذبابة الفاكهة في النوع البري والخلفيات المعدلة وراثيا. البروتوكول هو أيضا ذات الصلة للدراسات التي تركز على تعبئة كرية دموية بعد التحدي المناعة أو الإصابة، والإشارات التي يسببها وراثيا أو بيئيا الذي يقوم بتشغيل تعبئة hemocytes المقيمين أو التغيرات في مجموع عدد كرية دموية (إعادة النظر في 4). وتجدر الإشارة إلى أنه في حالات دي سابق لأوانهfferentiation والإفراج عن hemocytes من الغدة الليمفاوية، مع التمييز الجنينية / اليرقات مقابل الأنساب الغدة الليمفاوية قد تكون محدودة بسبب نمط التعبير لمراسل كرية دموية الفلورية المستخدمة. بروتوكول المعروضة هنا يعتمد على العيش التصوير، hemocytes fluorescently المسمى. في المستقبل، يمكن تعديله للسماح للكشف عن الخلايا أفرج عنه بعد التثبيت، على سبيل المثال، وذلك باستخدام مناعية. في هذه الحالة، قد يحتاج البروتوكول يمكن تكييفها لضمان التصاق كاملة من خلايا الدم، على سبيل المثال عن طريق زيادة مرات التصاق الحضانة، وإضافة طلاء لاصق الشريحة، مثل كونكانافالين A. منذ الأسلوب يسمح استرجاع hemocytes والسابقين التلاعب بها الجسم الحي، وسوف تستفيد مجموعة واسعة من الدراسات البيولوجية والبيوكيميائية التنموية، الخلية. تم العثور على خلايا المقيمين وتعميم الدم أثناء جميع مراحل تال للمرحلة الجنينية التنموية من ذبابة الفاكهة وغيرها من اللافقاريات 22، suggestiنانوغرام أن تكيف هذه الطريقة سوف تستفيد مجموعة واسعة من الدراسات ما بعد نظام المكونة للدم اليرقات ذبابة الفاكهة.

وقد أدى البحث في نموذج اللافقاريات ذبابة الفاكهة السوداء البطن اكتشاف المناعة الفطرية 1، وسهلت فهم مختلف جوانب التنمية خلايا الدم ويمكن تقسيم 2-4. تكون الدم ذبابة الفاكهة في نسب hemocytes الجنينية / اليرقات، التي تنشأ في الجنين والتوسع في يرقة، وسلالته من الغدة الليمفاوية hemocytes 4،5. هنا، نقدم البروتوكول الذي يركز على نسب hemocytes الجنينية / اليرقات، التي تضم في يرقة ذبابة الفاكهة بشكل رئيسي plasmatocytes (الضامة) وخلايا الكريستال القليلة 4. في اليرقة، hemocytes الجنين لا تزال قائمة واستعمار المتكررة segmentally ومحطة جيوب المكونة للدم (هبس) الواقعة بين البشرة وطبقات العضلات من جدار الجسم اليرقات 5،6. بناء على طبيعتها كما الضامة تجديد الذات 6 إقامتهم السائدة في microenvironments الأنسجة المحلية 6و 7 و نسبهم من أقرب خلايا الدم الناشئة خلال التنمية 6،8، وتعتبر هذه الفئة من السكان خلايا الدم مماثلة لأنسجة الضامة الفقارية تجديد الذات، وهي النسب التي تم تحديدها مؤخرا النخاعي مستقل في مجموعة متنوعة من الأنواع 4،9،10. ومع ذلك، في ذبابة الفاكهة، بعض أو كل هذه الخلايا المقيمة تظهر أيضا مرونة لتؤدي إلى أنواع خلايا الدم الأخرى مثل خلايا الكريستال 11،12. hemocytes اليرقات هي في الغالب المقيمين (اطئة)، ولكن في حالة ثابتة دينامية بين مختلف هبس. يتم اطلاق سراحهم تدريجيا في التداول، ولا سيما مع اقتراب 3 يرقة طور مرحلي الثالثة pupariation 5-7. التحديات المناعة أو الإصابة أو الميكانيكية الرصاص اضطراب سابق لأوانه، في الحالة الأخيرة عكسها، وتعبئة hemocytes المقيمين في الدملمف 4،6،13. واشارت دراسات سابقة أن المقيمين وتداولهاhemocytes اليرقات هي من نفس النسب، ولكنها تختلف في لاصق أو صاروخ موجه ممتلكاتهم 6،7،13،14. العزلة انتقائية تعميم مقابل hemocytes المقيمين كشفت مستويات مرتفعة من انتشار بين السكان كرية دموية المقيمين، مما يشير إلى تعرضهم للمنبهات الاستقرائي من هبس اليرقات هبس 6. ذبابة الفاكهة تصطف من قبل البشرة وطبقات العضلات وزيادة تأوي مجموعات الخلايا العصبية الحسية من الجهاز العصبي المحيطي (السندات الإذنية) وظيفة الكبد تشبه oenocytes 6. وظيفيا، وقد أثبتت التجارب الاجتثاث خلية متحولة وراثية أن الخلايا العصبية الحسية الموجودة في هبس تدعم بقاء الغذائي وتوطين hemocytes اليرقات 6. نحن هنا تصف طريقة لعزل محددة وتقدير من المقيمين وتعميم hemocytes من يرقات ذبابة الفاكهة واحدة، وبروتوكول للتعبئة كرية دموية الميكانيكية. أساليب يمكن استخدامها لخارج الجسم الحيدراسة hemocytes ويمكن أيضا أن تتكيف مع مراحل تطور ذبابة الفاكهة الأخرى مثل خادرة والكبار، وأنظمة اللافقارية الأخرى. منذ دراسات سابقة لم تفرق بين المقيمين وhemocytes المتداولة، ويوفر هذا البروتوكول معيارا مشتركا لدراسة خلايا الدم المقيمين وسوف تساعد على زيادة الاتساق في أبحاث الخلايا الدموية اللافقاريات. أولا، يصف كرية دموية التسييل / كشط الفحص العزلة الفرق النوعي والكمي الآلي من الفلورسنت المقيمين بعلامات البروتين وتعميم السكان كرية دموية من يرقات ذبابة الفاكهة واحدة؛ وينص البروتوكول خيارين لالمجاهر العادية والبلاط مجهزة المسح الضوئي (الشكل 1). ونتيجة لذلك، يتم الحصول على نسبة من hemocytes المتداولة وعدد من hemocytes في يرقة. ويعتمد هذا الأسلوب على يرقات ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين فلوري بين خلايا دمهمعدد السكان. اختيار السائق كرية دموية أو مراسل يحدد النتيجة، أي التي تصور السكان من خلايا الدم وكميا. لتسمية أساسا الضامة (plasmatocytes)، والتي تتكون من الغالبية العظمى من المقيمين وتعميم السكان كرية دموية لليرقة ذبابة الفاكهة 6، وتشمل الجينات المحورة مناسبة HML Δ-DsRed 6، HmlΔ -GAL4 15، PXN -GAL4 16، CRQ-GAL4 (من قبل H. Agaisse 16)، أو آكلى لحوم البشر-GAL4 17؛ لوصفها السكان قليل نسبيا من الخلايا وضوح الشمس، وخطوط مناسبة هي BcF6-CFP و-GFP 18، أو LZ-GAL4 (من قبل J. بولوك 19)؛ لlamellocytes وضع العلامات، ونوع من الخلايا المتخصصة التي يسببها أساسا من التحديات وإصابة 13 المناعية، على سبيل المثال، MSNF9mo-mCherry يمكن استخدامها 17. يتم التعبير عن بعض السائقين المعدلة وراثيا في مجموعة واسعة من الدم متباينةالخلايا والأسلاف، مثل و- GAL4 20، التي تصف حوالي 80٪ من مجموع خلايا الدم اليرقات 20. يرجى ملاحظة أنه في جميع الحالات التي تستخدم فيها السائقين GAL4، مطلوب بالاشتراك مع UAS-GFP أو آخر البروتين الفلوري UAS-التحوير. في قسم النتائج، ويستخدم هذا الأسلوب لمراقبة عدد خلايا الدم وسلوك التداول على مدى نمو اليرقات. ثانيا، يصف كرية دموية اضطراب الفحص خطوة السابقة تهدف إلى فصل hemocytes المقيمين عن طريق التلاعب الخارجي، والذي يسمح لاحقا تقييم قدرة hemocytes لإعادة تلتزم وموطن هبس ضمن إطار زمني محدود (30-60 دقيقة) 6. وعادة ما يتبع هذا الاختبار من قبل التسييل / كشط الفحص لتحديد نسبة تعميم hemocytes في يرقة. نقدم بروتوكول مبسط لهذا الاختبار (الشكل 1D)، والذي يستخدم اضطراب من قبل vortexing الطرافةحبات ح الزجاج، وبدلا من التلاعب يرقة واحدة مع فرشاة الطلاء كما هو موضح سابقا 6. في قسم النتائج، ويستخدم هذا الاختبار لإثبات أن تطفو hemocytes فصل عابر في الدملمف ويمكن استردادها في جزء من تعميم hemocytes. الفحص مفيد أيضا لتحديد الاختلافات في hemocytes في هم صاروخ موجه / التصاق إلى مواقع المقيمين، مقارنة على سبيل المثال، العديد من خلفيات وراثية أو شروط التحفيز. يرجى ملاحظة أن هذا التلاعب الميكانيكية يعكس عملية عكسها ويختلف عن infection- أو الناجم عن الإصابة تعبئة كرية دموية المقيمين، التي عادة ما تكون ليس عكسها في فترة زمنية قصيرة 4،13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6cm/9cm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>One for each genotype to be evaluated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water squirt bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spoon/spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. a &#34;liner&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cavity dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen: Super PAP PEN IM3580</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila cell culture media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two 1ml syringes with needles (27G &#189;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>For dissections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 212-600 micron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>One per genotype evaluating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: Hml&#916;-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or Hml&#916;-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope with camera attachment</td>
			<td>Leica or Keyence</td>
			<td></td>
			<td>With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying blood cell populations of the drosophila melanogaster larva

في الفقاريات، وينظم تكون الدم عن طريق microenvironments الاستقرائي (منافذ). وبالمثل، في نموذج اللافقاريات كائن ذبابة الفاكهة السوداء البطن، وقد تم تحديد microenvironments الاستقرائي المعروفة باسم جيوب المكونة للدم اليرقات (هبس) كمواقع التشريحية لتطوير وتنظيم خلايا الدم (hemocytes)، ولا سيما من سلالة بلعم تجديد الذات. هبس هي كرر segmentally جيوب بين البشرة وطبقات العضلات اليرقة، التي تضم أيضا الخلايا العصبية الحسية في الجهاز العصبي المحيطي. في اليرقة، يتعرضون المقيمين (لاطئة) hemocytes لمكافحة أفكارك لاصقة والعظة التكاثري من هذه الخلايا العصبية الحسية وعناصر محتملة أخرى للهبس، مثل العضلات وطبقات البطانة الظهارية. خلال التطور الطبيعي، الإفراج التدريجي عن hemocytes المقيمين من الوقود هبس سكان hemocytes المتداولة، الذي يبلغ ذروته في الإفراج عن موالحادي من hemocytes المقيمين في بداية التحول. الاعتداءات المناعة والإصابة البدنية أو اضطراب الميكانيكية تؤدي الى الافراز السابق لأوانه hemocytes المقيمين في التداول. التحول من hemocytes اليرقات بين المواقع المقيمين والدورة الدموية يزيد من الحاجة إلى معيار مشترك / إجراءات لعزل انتقائي وتحديد هذين الشعبين من خلايا الدم من يرقات ذبابة الفاكهة واحدة. وفقا لذلك، ويصف هذا البروتوكول وسيلة الآلي لاطلاق سراح وتحديد المقيمين وhemocytes تعميم من اليرقات واحدة. طريقة يسهل النهج خارج الحي، ويمكن تكييفه لخدمة مجموعة متنوعة من مراحل تطور ذبابة الفاكهة والكائنات اللافقارية الأخرى.

لتوضيح نتائج نموذجية من أساليب وصفها، وأول من استخدم كرية دموية التسييل / كشط الفحص لتحديد تطور أعداد كرية دموية اليرقات وإقامتهم على مدى نمو اليرقات (الشكل 4). تم عزل المقيمين وتعميم السكان كرية دموية اليرقات من اليرقات واحدة (HML Δ-GAL4، UAS-GFP، و-GAL4 لتسمية الغالبية العظمى من hemocytes اليرقات) وكميا باستخدام يماغيج. أفواج من اليرقات الحجم 1.2 ملم (~ 48 AEL ساعة أو 1 شارع الطور)، و 2.5 ملم (~ 80 ساعة AEL أو في وقت متأخر 2 الثانية الطور)، و 3.5 مم تم فحص (~ 96 ساعة AEL أو 3 طور مرحلي الثالثة) (الشكل 4) . أرقام كرية دموية توسعت على مدى نمو اليرقات، ربط مع وتجاوز التقديرات السابقة على أساس المجهر الضوئي من صبغ الملون اليرقات 7 والعد حية من البروتين المسمى hemocytes الفلورسنت من خلال بشرة اليرقات 6. في 1 شارع الإضافيةوكانت القطران اليرقات كل hemocytes تقريبا المقيمين، في حين أن جزء من hemocytes المتداولة زادت تدريجيا على مدى نمو اليرقات (الشكل 4B، C)، بما يتفق مع المنشورات السابقة 6،7. التالي درسنا ما إذا كان أسلوب يرصد بأمانة الانتقال من hemocytes بين السكان المقيمين والمنتشرة. الاستفادة من هذه الظاهرة التي hemocytes المقيمة يمكن فصل عابر من قبل اضطراب الميكانيكية وأعادوا الانضمام إلى مواقع المقيمين بها بشكل عفوي 6، فإننا تشتت hemocytes مقيمة من قبل vortexing مع الخرز الزجاجي كما هو موضح في كرية دموية اضطراب الفحص. في الواقع، أدى اضطراب الميكانيكية اليرقات إلى زيادة هائلة في عدد السكان تعميم hemocytes على حساب hemocytes المقيمين (الشكل 5). بعد فترة نقاهة من 45 دقيقة، وكان hemocytes عاد إلى حد كبير إلى حالتها ملتصقة، سواء عن طريق التفتيش البصري والتي كمانسبة sessed الخلايا المتداولة (الشكل 5D، E). كما هو متوقع، إلا أن مجموع أرقام كرية دموية مستقرة على مر الزمن، على الرغم من التحول من hemocytes بين السكان تعميم والمقيمين. اتخذت عدة اعتبارات إضافية في الاعتبار. للتأكد من أن vortexing للم يسبب تلف الأنسجة كبير، vortexing لمع أنجز الخرز الزجاجي في وجود التريبان الأزرق (سيغما) لفترات زمنية مختلفة (1، 5، 20 دقيقة). لم كلا 1 و 5 دقائق vortexing للا يسبب أي اضطراب النسيج واضحة، في حين أدى 20 دقيقة vortexing لفي مناطق صغيرة من ضرر، تشبه الأضرار الناجمة عن غرز إبرة تستخدم السيطرة الايجابية (التكميلي الشكل 1). بينما الضرر الداخلي البشرة أو الأنسجة الأخرى دون ضرر بشرة لا يمكن استبعاد، يبدو أن هذا السيناريو المحتمل بالأحرى hemocytes من 1 دقيقة والنمط المتوقع والإطار الزمني 5 المعالجة دقيقة اليرقات التقيد إعادة مشيرة الى انه من سلامة اليرقات لا تسويةد (التكميلي الشكل 1). في المقابل، vortexed اليرقات لمدة 20 دقيقة تعاني من نقص في إعادة التصاق، وحتى لا تظهر المرفقات تعميم hemocytes إلى مواقع البشرة الجروح، كما وصفت سابقا 14. وأخيرا، لإثبات استنساخ الأسلوب، قارنا مكررات البيولوجية من 2.5 ملم اليرقات من اثنين من التجارب السابقة، التي أجريت من قبل المجربون متميزة. كما هو موضح في الشكل 2 التكميلي، وأظهرت كل من الأفواج العدد الإجمالي للمقارنة من hemocytes في يرقة، ونسبة hemocytes المتداولة. أظهر الطالب ر الاختبار عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية، مما يشير إلى أن هذه الطريقة قابلة للتكرار وقابلة للتطبيق على نطاق واسع. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. كرية دموية التسييل / كشط واضطراب الفحص الصورة<html> etup والتخطيطي. (A) صورة واحدة إعداد الشرائح: خمسة مربعات 2mm في التصوير مع هدف 5X (B) بلاط إعداد الشرائح المسح الضوئي: أربعة مربعات 3 مم للتنزف التصوير / الورطات من ≤2.5 مم اليرقات مع مجهر مسح البلاط. أهداف الموصى بها للتصوير هي 5X أو 10X. (C) انزف / كشط الفحص quantifications التخطيطي والناتجة باستخدام يماغيج (D) في اضطراب الفحص، وتعطلت نمط كرية دموية ميكانيكيا قبل vortexing اليرقات مع الخرز الزجاجي. يسمح اليرقات لاسترداد خلال فترة 45 دقيقة خلالها hemocytes إعادة الانضمام إلى جيوب المكونة للدم. خصائص لاصقة من hemocytes يمكن تقييمها بواسطة هذه الطريقة، قياس نسبة hemocytes في التداول بعد الاضطرابات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <html> طرق &quot;&gt; <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" width="700" /> الشكل 2. التسييل / كشط الفحص للافراج عن تعميم وhemocytes المقيمين. (A) لتنزف يرقة، يتم إجراء شقوق بطني في نهايات الخلفي والأمامي لليرقة (مقص الرمز). (B) Hemocytes في التداول سوف تتدفق من شقوق وتستقر على سطح الشريحة. (C) تقع الغدة الليمفاوية (LG) وتمركزها، دون ثقب عليه. يتم الافراج hemocytes المقيم عن طريق لكز و / أو كشط اليرقة بإبرة. hemocytes (D) مقيم على الشريحة. (E، F) يتم تكرار عملية كشط حتى يتم تحرير كافة hemocytes المقيمين. يتم ترك الذبيحة اليرقات التي تحتوي على الغدة الليمفاوية سليمة وراءها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> س: المحافظة على together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig3highres.jpg" width="600" /> الشكل 3. الآلي الكمي لhemocytes باستخدام يماغيج. (A، B) بعد فتح ملف صورة كرية دموية في يماغيج، يتم ضبط مستوى عتبة أدنى لحصر جميع الخلايا في الصورة. (C، D) تحليل الجزيئات يتطلب تحديد حجم بكسل الخلية، دائرية، ونتيجة قراءات الشكل (على سبيل المثال، تراكب الخطوط العريضة). (E) ملخص نافذة عرض عدد من hemocytes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig4highres.jpg" width="700" /> الرقم 4. ممثل النتائج (1). عدد كرية دموية والدولة المقيمة على<html> مسار نمو اليرقات. (A) لمحة عامة عن مراحل اليرقات المستخدمة؛ 1 شارع الطور (48 AEL ساعة؛ ~ 1.2 ملم طول)؛ 2 الثانية الطور (80 ساعة AEL؛ 2.5 مم طول)؛ 3 طور مرحلي الثالثة (96 ساعة AEL؛ ~ 3.5 مم طول). النمط الجيني هو HML Δ-GAL4، UAS-GFP. كان-GAL4. وأكد مراحل من خلال تقييم mouthhooks اليرقات. (B) بار الرسم البياني لتعميم وأرقام كرية دموية المقيمين في مراحل اليرقات منها. (C) نسبة تعميم hemocytes. لاحظ أن جزء من hemocytes تعميم يزيد بشكل غير متناسب على مدى نمو اليرقات. (D) مجموع hemocytes، الناتجة عن مجموع تعميم وhemocytes المقيمين في يرقة. وتم قياس كمية Hemocytes باستخدام طريقة التسييل / كشط. ن ≥ 6 يرقة / حالة، تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري، والنتائج المؤكدة في 3 تجارب تكرار مستقلة.JPG &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" width="700" /> الرقم 5. ممثل النتائج (2). آثار اضطراب الميكانيكي على الإقامة كرية دموية. (AC) مثال على يرقة قبل وبعد vortexing لمع الخرز الزجاجي، تليها الانتعاش 45 دقيقة (A) لا تحكم اضطراب؛ يتم ترجمة hemocytes في جيوب المكونة للدم (B) نمط كرية دموية تعطل في 0 دقيقة بعد vortexing ليرقات في تعليق الخرز الزجاجي والماء (C) نمط كرية دموية في 45 دقيقة من الانتعاش بعد اضطراب؛. وقد نقلت العديد من hemocytes إلى جيوب المكونة للدم. ملاحظة تضخم الأوعية الدموية الظهرية المجموعات المرتبطة بها والمشارب الظهرية التي هي مواقع السائدة في وقت مبكر من تراكم بعد اضطراب (السهام). النمط الجيني هو HML Δ-GAL4، UAS-GFP؛ وقال انه اذا ستشغل-GAL4 س. (D) نسبة تعميم hemocytes كميا من خلال طريقة التسييل / كشط. (E) مجموع hemocytes، الناتجة عن مجموع تعميم وhemocytes المقيمين في يرقة. ن ≥ 4 يرقات / حالة، تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري، والنتائج المؤكدة في 3 تجارب تكرار مستقلة. اختبار t الطالب لتأكيد أهمية، NS (غير مهم) **، (P ≤ 0.05)، ** (P ≤ 0.01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva at JoVE.com

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

يعاير بالسكان خلية الدم لل<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; اليرقة

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

assaying-blood-cell-populations-of-the-drosophila-melanogaster-larva

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

12.2K Views.  University of California San Francisco. Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Video: Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

تربية ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تحت ممحوضة ومعروف المعايشات شروط

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

عزل بالسكان خلية حول الأوعية متعددة القدرات السلائف من قلب الإنسان الأنسجة

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

بروتوكولات لتصور الستيرويدي المنشأ أجهزة وهيئات التفاعلية مع المناعية في ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

طرق لاختبار اضطراب الغدد الصماء في الميلانوجاستر Drosophila

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

فحص لسلامة حاجز الدم في الدماغ في دروسوفيلا melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

التقاط استجابة إصابات القلب من مجموعات الخلايا المستهدفة عن طريق مسح القلب التصوير ثلاثي الأبعاد

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

جيل من iPSC الإنسان القائم على الدم في الدماغ حاجز رقاقة

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.