ويمكن استخدام هذه الاستراتيجيات الحساسة لتقييم فعالية تثبيط مثبطات الكيميائية و بالاشتراك مع CRISPR-Cas9 حذف الجينات للتحقيق في أهداف المخدرات. بدلاً من استخدام مقايسة نقطة النهاية ، يمكن رصد نمو الطفيليات بمرور الوقت للسماح بحساب وقت مضاعفة الطفيلي باستخدام بروتين مراسل حساس. ويمكن أن يتم توسيع نطاق هذا الفحص في 384 أو 1536 من اللوحات الدقيقة جيدا لاختبار مركبات متعددة أو لفحص المكتبات بطريقة عالية الإنتاجية.
ويمكن تعديل هذه الاستراتيجية لتحديد حجم نمو غيرها من الجراثيم الميكروبية داخل الخلايا واستجاباتها للدواء ذات الأهمية. لأداء فحص نمو Toxoplasma القائم على لوسيفيراز، ابدأ باستنشاق الوسيلة بعناية من الثقافات ذات المنصات 96-جيداً من الخلايا الليفية الليفية للسلذة البشرية وتطعيم 150 ميكرولترات من تعليق الطفيلي B في الآبار في شكل صف ثلاثة أعمدة وخمسة. بعد فترة أربع ساعات من الاحتضان في حاضنة ثقافة الخلية ، استلهم بعناية الوسط من كل بئر لإزالة الطفيليات غير الغازية وملء الآبار في كل صف ولكن الصف الأول مع درجة حرارة الغرفة الفينول الأحمر المتوسط الحر.
ثم إضافة 100 ميكرولترات من 12.5 حل الركيزة luciferase micromolar في برنامج تلفزيوني في كل بئر من الصف العلوي واحتضان microplates لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح تحلل الخلية الكاملة. في نهاية الحضانة ، وقياس نشاط luciferase على قارئ microplate. كل قراءة تمثل العدد الأولي من الطفيليات الغازية في أربع ساعات بعد العدوى.
كرر التحليل كل 24 ساعة للأيام الأربعة التالية دون تغيير الوسيط. لحساب تغيير الطية تطبيع نمو الطفيليات ، يمكن تقسيم كل قراءة من القراءة الأولية في أربع ساعات بعد العدوى. السجل 2 من تطبيع أضعاف تغيير نمو الطفيليات يمكن بعد ذلك رسمها ضد كل نقطة زمنية وتخضع لوظيفة الانحدار الخطي للحصول على المنحدر الذي يمثل الوقت مضاعفة.
لتقييم فعالية تثبيط مركب الاهتمام على نمو Toxoplasma ، والثقافة قلفة الإنسان في الألواح الليفية 96 جيدا لمدة سبعة أيام على الأقل قبل تلقيح كل بئر من الخلايا مع 150 ميكرولترات من الطفيليات كما هو موضح لمدة أربع ساعات في 37 درجة مئوية و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون. أثناء الحضانة، وإعداد مجمع الفائدة في ثمانية تركيزات مختلفة في خزان 12-آبار عن طريق التخفيف التسلسلي. تمييع المركبات في خزان 12 بئرا في تخفيف واحد إلى ثلاثة عن طريق الأنابيب كل خليط صعودا وهبوطا عدة مرات مع ماصة ملليلتر واحد.
في أربع ساعات بعد العدوى، استبدال المتوسطة في كل بئر من الأعمدة من 2 إلى 9 مع 150 ميكرولترات من المتوسطة تستكمل مع كل تخفيف من مركب، وترك العمود الأول مليئة المتوسطة العادية لتكون بمثابة السيطرة غير المعالجة. ثم العودة إلى ثقافة الخلية حاضنة ثقافة الخلية لمدة 96 ساعة وقياس نشاط luciferase لكل بئر لتحديد النسبة المئوية لتثبيط النمو في الثقافات في كل تركيز من مركب. لحساب نشاط لوسيفيراز تطبيع كنسبة مئوية، تقسيم متوسط نشاط لوسيفرايز لكل تركيز مركب على متوسط نشاط لوسيفراز المستمدة من الطفيليات غير المعالجة.
ثم استخدام برنامج الرسوم البيانية المناسبة لرسم الأنشطة لوسيفرايز تطبيع ضد مركب الفردية وحساب تركيز مثبطة نصف أقصى لكل مركب. لتوليد بناء plasmid التعبير عن RNA واحد دليل وكاس9 لحذف جين من الاهتمام، انتقل إلى صفحة الموارد الجينوم Toxoplasma واسترداد تسلسل الترميز الجيني كامل بما في ذلك introns و exons جنبا إلى جنب مع 1.5 كيلوبيس خمسة وثلاث مناطق غير مترجمة الرئيسية. نسخ تسلسل TgCPL المسترجعة في برنامج تحليل التسلسل وتسمية المناطق الأولية الخمسة و الثلاث غير المترجمة.
في الصفحة مورد الجينوم Toxoplasma انقر فوق تحميل وملفات البيانات Current_Release. في المجلد T.gondii GT1، حدد FASTA. من مجلد البيانات، قم بتنزيل ملف تسلسل الجينوم سلالة Toxoplasma gondii GT1.
ثم إنشاء مجلد محلي يسمى توكسوبلازما الجينوم في برنامج تحليل تسلسل الحمض النووي واستيراد ملف تسلسل الجينوم Toxoplasma إلى المجلد. حدد أدوات، واستنساخ، والعثور على مواقع CRISPR وتعيين ثلاثة رئيس الوزراء Cas9 لموقع PAM الموقع. حدد RNA دليل واحد يوضح درجة عالية من التحديد، عموما أكبر من 98٪، ويفتقر إلى G بعد NGG.
يقع عادة RNA واحد دليل مختارة في مواقع قريبة من بداية ووقف codons من الجين من الفائدة. ثم استخدم PCR premix مع الإعدادات كما هو مبين في الجدول لإجراء تفاعل PCR لتعديل plasmid الموجودة مسبقا التعبير عن الجيش الملكي النيبالي دليل واحد الذي يستهدف الجين TgUPRT. بالنسبة لTranssmids toxoplasma ، اخلط اثنين من ميكروغرام من الحمض النووي قالب إصلاحها مع 20 ميكروغرام من دليل واحد RNA Cas9 التعبير plasmids ومزيج 400 ميكرولترات من resuspension الطفيليات ، والحمض النووي ، وخمسة ميكرولترات من 200 ملليمولار ATP 500 مللي ميللي خفضت الجلوتاثيون في 1.5 ملليلتر الطرد المركزي.
إضافة العازلة cytomix لجعل حجم يصل إلى 500 ميكرولترس حسب الضرورة ونقل خليط الحمض النووي الطفيلي إلى فجوة أربعة ملليمتر مع cuvette الكهربائي. ثم الكهربائي الطفيليات في اثنين كيلوفولت و 50 أوم من المقاومة. لاستنساخ الطفيليات بالضربة القاضية ، قم أولاً بتخفيف الطفيليات على خطوتين لتحقيق 10 طفيليات لكل ملليلتر من D10 medium مع التركيز المناسب للمضادات الحيوية.
بعد ذلك ، نقل 150 ميكرولتردات من الطفيليات المنقية resuspended إعادة إلى كل بئر من 96 بئر microplate المبذرة مسبقا مع الخلايا الليفية القلفة واحتضان microplate في 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة سبعة أيام. في نهاية الحضانة، وتحديد الآبار التي تحتوي على لوحة واحدة ونقل 75 ميكرولترات من الخلايا الليفية البشرية المتلقّح 1.5 ملليلترة 1.5 ميلليلتر. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في 10.25 ميكرولترات من العازلة تحلل التي تحتوي على عازلة التخفيف في DNA إطلاق المضافة.
ثم احتضان العينات لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة ودقيقتين في 98 درجة مئوية قبل إجراء PCR لاختبار التكامل بين كاسيت مقاومة الدواء وفقدان جينة الاهتمام. يمكن تحديد فعالية تثبيط LHVS والنوع البري في سلالات دلتا CPL عن طريق التخطيط لأنشطتها لوسيفيراز ضد تركيزات مثبطات مختلفة. بعد PCR، يتم الخطية البلازميد المتحول وتحميلها في هلام agarose 1٪للتحقق من التضخيم الناجح.
بعد استخراج الجل وتحويل الإشريكية القولونية ، يمكن فحص المستنسخات التي تحتوي على البلازميدات المتوقعة عن طريق الهضم endonuclease المقيد في تسلسل الحمض النووي. بعد إصلاح التضخيم قالب، يمكن استخدام agarose هلام electrophoresis للتحقق من الحجم الصحيح للمنتج PCR. وعموما، يتم اختيار سبعة إلى ثمانية مستنسخات للفحص الأولي للتحقق من حذف تسلسل الترميز لجين الاهتمام، يليه الكشف عن الأسلحة الخمسة والثلاثة الرئيسية للمساعدة في الحد الأدنى من العدد الإجمالي للمستنسخات التي سيتم فحصها.
ويمكن استكمال التحقق من خلال مناعة إذا كان أي جسم مضاد يعترف بالبروتين المستهدف متاحًا. قبل الحصول على قياسات نشاط لوسيفراز ، يجب فحص لوحة صغيرة واضحة مع عدوى وهمية تحت المجهر للتأكد من أن الطفيليات لا تُقم تماماً بالخلايا المضيفة.
