Queste strategie sensibili possono essere utilizzate per valutare l'efficacia di inibizione degli inibitori chimici e in combinazione con la delezione genica CRISPR-Cas9 per indagare gli obiettivi del farmaco. Invece di usare un test endpoint, la crescita dei parassiti può essere monitorata nel tempo per consentire il calcolo del tempo di raddoppio dei parassiti utilizzando una proteina reporter sensibile. Questo saggio può potenzialmente essere scalato in micropiatte a 384 o 1.536 pozzi per il test di più composti o per lo screening delle librerie in modo ad alta produttività.
Questa strategia può essere modificata per quantificare la crescita di altri agenti patogeni microbici intracellulari e le loro risposte al farmaco di interesse. Per eseguire un test di crescita del Toxoplasma a base di luciferasi, iniziare aspirando attentamente il mezzo da colture micropiatte pre-seminate a 96 pozzetti di fibroblasti di prepuzio umano e inoculare 150 microlitri di sospensione del parassita B nei pozzi in un formato a tre colonne cinque file. Dopo un'incubazione di quattro ore nell'incubatore di coltura cellulare, aspirare attentamente il mezzo da ogni pozzo per rimuovere i parassiti non invasi e riempire i pozzi in ciascuna ma la prima fila con mezzo privo di fenolo rosso a temperatura ambiente.
Quindi aggiungere 100 microlitri di una soluzione di substrato di luciferasi micromolare 12,5 in PBS in ogni pozzo della fila superiore e incubare le micropiatte per 10 minuti a temperatura ambiente per consentire la lisi cellulare completa. Al termine dell'incubazione, misurare l'attività della luciferasi su un lettore di micropiatte. Ogni lettura rappresenta il numero iniziale di parassiti invasi a quattro ore dopo l'infezione.
Ripetere l'analisi ogni 24 ore per i prossimi quattro giorni senza cambiare il mezzo. Per calcolare il cambio di piegatura normalizzato della crescita dei parassiti, ogni lettura può essere divisa per la lettura iniziale a quattro ore dopo l'infezione. Il log 2 del cambio di piegatura normalizzato della crescita dei parassiti può quindi essere tracciato contro ogni punto di tempo e sottoposto a una funzione di regressione lineare per ottenere la pendenza che rappresenta il tempo di raddoppio.
Per valutare l'efficacia dell'inibizione di un composto di interesse sulla crescita del Toxoplasma, coltura di fibroblasti di prepuzio umano in micropiastrine da 96 pozzetti per almeno sette giorni prima di inoculare ogni pozzo di cellule con 150 microlitri di parassiti come dimostrato per quattro ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Durante l'incubazione, preparare il composto di interesse a otto diverse concentrazioni in un serbatoio di 12 pozzi per diluizione seriale. Diluire i composti in un serbatoio di 12 pozzetti in una diluizione uno-a-tre tubazione ogni miscela su e giù più volte con una pipetta da un millilitro.
A quattro ore dall'infezione, sostituire il mezzo in ogni pozzo dalle colonne da due a nove con 150 microlitri di mezzo integrati con ogni diluizione del composto, lasciando la prima colonna riempita con mezzo regolare per fungere da controllo non trattato. Quindi riportare le colture cellulari nell'incubatore di coltura cellulare per 96 ore e misurare l'attività della luciferasi per ogni pozzo per determinare la percentuale di inibizione della crescita nelle colture ad ogni concentrazione di composto. Per calcolare l'attività della luciferasi normalizzata come percentuale, dividere l'attività media della luciferasi per ogni concentrazione composta per l'attività media della luciferasi derivata dai parassiti non trattati.
Quindi utilizzare un programma software di grafo appropriato per tracciare le attività della luciferasi normalizzata rispetto al singolo composto e per calcolare la concentrazione inibitoria semi massima per ogni composto. Per generare un costrutto plasmide che esprime RNA a guida singola e Cas9 per eliminare un gene di interesse, passare alla pagina Toxoplasma Genomics Resource e recuperare l'intera sequenza di codifica genica inclusi gli introni e gli esoni insieme alle 1,5 kilobase cinque e tre regioni prime non tradotte. Copiare la sequenza TgCPL recuperata nel software di analisi delle sequenze ed etichettare le cinque e tre prime regioni non tradotte.
Nella pagina Risorsa genomica Toxoplasma fare clic su Download, File di dati e Current_Release. Nella cartella T.gondii GT1 selezionare FASTA. Dalla cartella dati, scaricare il file di sequenza del genoma del ceppo Toxoplasma gondii GT1.
Quindi creare una cartella locale chiamata Toxoplasma Genome nel software di analisi della sequenza del DNA e importare il file di sequenza del genoma del Toxoplasma nella cartella. Selezionate Strumenti (Tools), Clonazione (Cloning) e Trova siti CRISPR (Find CRISPR Sites) e impostate tre cas9 prime prime per la posizione del sito PAM. Selezionare un RNA a guida singola che dimostri un punteggio di specificità elevato, generalmente maggiore del 98% e privo di una G che segue l'NGG.
L'RNA a guida singola selezionato si trova di solito in siti vicini all'inizio e ferma i codoni del gene di interesse. Quindi utilizzare una premiscela PCR con le impostazioni come indicato nella tabella per eseguire una reazione PCR per modificare il plasmide preesistente esprimendo RNA a guida singola che prende di mira il gene TgUPRT. Per la trasfezione di Toxoplasma, mescolare due microgrammi di DNA modello riparato con 20 microgrammi dei plasmidi di espressione RNA Cas9 a guida singola e mescolare 400 microlitri di resospensione parassita, DNA e cinque microlitri di 200 millimolare ATP 500 millimolare ridotto glutatione in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri.
Aggiungere il buffer cytomix per portare il volume totale fino a 500 microlitri se necessario e trasferire la miscela di DNA del parassita in uno spazio di quattro millimetri con cuvetta di elettroporazione. Quindi elettroporare i parassiti a due kilovolt e 50 ohm di resistenza. Per clonare i parassiti knockout, eseguire prima una diluizione in due fasi dei parassiti per ottenere 10 parassiti per millilitro di mezzo D10 integrato con l'appropriata concentrazione antibiotica.
Successivamente, trasferire 150 microlitri dei parassiti purificati rimescolati in ogni pozzo di una micropiastra a 96 pozzetti pre-seminata con fibroblasti di prepuzio e incubare la micropiastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per sette giorni. Al termine dell'incubazione, identificare i pozzi contenenti una singola placca e trasferire 75 microlitri dei fibroblasti del prepuzio umano resopensi infetti da Toxoplasma da ogni pozzo della coltura di micropiastrine a 96 pozzetti in singoli tubi da 1,5 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimescolare il pellet in 10,25 microlitri di tampone di lisi contenente tampone di diluizione nell'additivo per il rilascio del DNA.
Quindi incubare i campioni per quattro minuti a temperatura ambiente e due minuti a 98 gradi Celsius prima di eseguire PCR per testare l'integrazione della cassetta di resistenza al farmaco e la perdita del gene di interesse. Gli efficaci di inibizione dell'LHVS e del tipo selvatico nei ceppi delta CPL possono essere determinati tracciando le loro attività di luciferasi contro diverse concentrazioni di inibitori. Dopo la PCR, il plasmide mutato viene linearizzato e caricato in un gel di agarosio dell'1% per la verifica di un'amplificazione riuscita.
Dopo l'estrazione del gel e la trasformazione di E.coli, i cloni contenenti i plasmidi previsti possono essere schermati per restrizione della digestione dell'endonucleasi nel sequenziamento del DNA. Dopo l'amplificazione del modello di riparazione, l'elettroforesi del gel di agarosio può essere utilizzata per verificare le dimensioni corrette del prodotto PCR. Generalmente, da sette a otto cloni sono selezionati per lo screening iniziale per verificare la cancellazione della sequenza di codifica del gene di interesse, seguita dal rilevamento dei cinque e tre bracci primi per aiutare a minimizzare il numero totale di cloni da vagliare.
Un'ulteriore verifica può essere completata mediante immunoblotting se è disponibile un anticorpo che riconosca la proteina bersaglio. Prima di ottenere misurazioni dell'attività della luciferasi, una micropiatta chiara con una finta infezione deve essere controllata al microscopio per garantire che i parassiti non liscivino completamente le cellule ospiti.
