Bu hassas stratejiler, kimyasal inhibitörlerin inhibisyon etkinliğini değerlendirmek ve ilaç hedeflerini araştırmak için CRISPR-Cas9 gen delemesi ile birlikte kullanılabilir. Bunun yerine bir uç nokta tetkik kullanarak, parazit büyüme hassas bir muhabir protein kullanarak parazit iki katına zaman hesaplama sağlamak için zaman içinde izlenebilir. Bu test potansiyel olarak 384 veya 1, 536 iyi mikroplakalar birden fazla bileşiklerin test etmek veya yüksek iş kadar bir şekilde kütüphanelerin taranması için ölçeklenebilir.
Bu strateji, diğer hücre içi mikrobiyal patojenlerin büyümesini ve bunların ilgi çekici ilaca verdikleri yanıtları ölçmek için değiştirilebilir. Luciferase tabanlı Toxoplasma büyüme testini gerçekleştirmek için, insan sünnet derisi fibroblastlarının önceden tohumlanmış 96 kuyulu mikroplaka kültürlerinden ortayı dikkatlice uyararak başlayın ve 150 mikrolitre parazit B süspansiyonunu üç sütun-beş sıra biçiminde kuyulara aşılayın. Hücre kültürü kuluçka dört saatlik kuluçka sonra, dikkatle işgal edilmeyen parazitleri kaldırmak ve oda sıcaklığında fenol kırmızı serbest orta ile her ama ilk satır da kuyuları doldurmak için her kuyudan orta aspire.
Daha sonra PBS'deki 12,5 mikromolar luciferase substrat çözeltisinin 100 mikrolitresini üst sıranın her kuyusuna ekleyin ve tam hücre lisisine izin vermek için mikroplakaları oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, bir mikroplaka okuyucu üzerinde luciferase aktivitesini ölçün. Her okuma, enfeksiyon dan sonra dört saat içinde işgal edilen parazitlerin ilk sayısını temsil eder.
Orta sını değiştirmeden önümüzdeki dört gün boyunca her 24 saatte bir analizi tekrarlayın. Parazit büyümesinin normalleştirilmiş kat değişimini hesaplamak için, her okuma enfeksiyon sonrası dört saatlik ilk okumaile bölünebilir. Parazit büyümesinin normalleştirilmiş kıvrım değişiminin günlük 2'si her zaman noktasına karşı çizilebilir ve katlama süresini temsil eden eğimi elde etmek için doğrusal bir regresyon işlevine tabi tutulabilir.
Toxoplasma büyüme ilgi bir bileşik inhibisyonunetkinliğini değerlendirmek için, kültür insan sünnet derisi fibroblastlar en az yedi gün boyunca 96-iyi mikroplakalar için parazitlerin her iyi aşılama önce 150 mikrolitre parazitler ile dört saat boyunca gösterdi 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit. Kuluçka sırasında, seri seyreltme ile 12 kuyulu bir rezervuar sekiz farklı konsantrasyonlarda faiz bileşik hazırlamak. Bileşikleri 12 kuyuluk bir rezervuardaki bire üç seyreltmede, her karışımı bir mililitrelik pipetle birkaç kez yukarı ve aşağı boruhaline vererek seyreltin.
Enfeksiyon sonrası dört saat olarak, her kuyuda iki ila dokuz sütunlar arasında orta yerine 150 mikrolitre orta bileşik her seyreltme ile takviye, tedavi edilmeyen kontrol olarak hizmet etmek için düzenli orta ile dolu ilk sütun bırakarak. Daha sonra hücre kültürlerini hücre kültürünü 96 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve bileşiklerin her konsantrasyonundaki kültürlerdeki büyüme inhibisyonunun yüzdesini belirlemek için her kuyu için luciferase aktivitesini ölçün. Normalleştirilmiş luciferase aktivitesini bir yüzde olarak hesaplamak için, her bileşik konsantrasyoniçin ortalama luciferase aktivitesini, tedavi edilmeyen parazitlerden elde edilen ortalama luciferase aktivitesine bölün.
Daha sonra normalleştirilmiş luciferase aktivitelerini tek tek bileşiğin karşısına çıkarmak ve her bileşik için yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu hesaplamak için uygun bir grafik yazılım programı kullanın. İlgi çeken bir geni silebilmek için tek kılavuzlu RNA ve Cas9'u ifade eden plazmid bir yapı oluşturmak için Toxoplasma Genomics Resource sayfasına gidin ve 1,5 kilobase beş ve üç ana çevrilmemiş bölgeyle birlikte intronlar ve ekonlar da dahil olmak üzere tüm gen kodlama dizisini alın. Alınan TgCPL sırasını sıra analizi yazılımına kopyalayın ve çevrilmemiş beş ve üç asal bölgeyi etiketleyin.
Toxoplasma Genomics Kaynak sayfasında İndir, Veri Dosyaları ve Current_Release'yi tıklatın. T.gondii GT1 klasöründe FASTA'yı seçin. Veri klasöründen Toxoplasma gondii GT1 strain genom dizi dosyasını indirin.
Daha sonra DNA dizi analizi yazılımında Toxoplasma Genom adlı yerel bir klasör oluşturun ve Toxoplasma genom dizi dosyasını klasöre aktarın. CrispR Sitelerini Bul araçları, Klonlama ve Bul'u seçin ve PAM site konumu için üç ana Cas9 prime ayarlayın. Yüksek özgüllük puanı gösteren, genellikle %98'den büyük ve NGG'den sonra G'den yoksun tek bir kılavuzLu RNA seçin.
Seçilen tek kılavuzlu RNA genellikle ilgi geninin başlangıç ve durdurma kodonları yakın yerlerde yer alır. Ardından, TgUPRT genini hedefleyen önceden varolan plazmid ifade eden tek kılavuzlu RNA'yı değiştirmek için bir PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için tabloda belirtilen ayarları içeren bir PCR premixkullanın. Toxoplasma transfeksiyonu için, iki mikrogram onarılmış şablon DNA'yı tek kılavuzlu RNA Cas9 ekspresyonu plazmidlerinin 20 mikrogramı ile karıştırın ve 1,5 mililitrelik bir santigrat tüpünde 200 milimolar ATP 500 milimolar azaltılmış glutatyon olmak üzere 400 mikrolitre parazit resuspension, DNA ve beş mikrolitreyi karıştırın.
Gerektiğinde toplam hacmi 500 mikrolitreye çıkarmak için sitomix tampon ekleyin ve parazit DNA karışımını elektroporasyon cuvette ile dört milimetrelik bir boşluğa aktarın. Sonra parazitleri iki kilovolt ve 50 ohm dirençle elektroporate. Nakavt parazitleri klonlamak için, ilk uygun antibiyotik konsantrasyonu ile desteklenen D10 orta mililitre başına 10 parazit elde etmek için parazitlerin iki adımlık seyreltme gerçekleştirin.
Daha sonra, 150 mikrolitre resuspended saflaştırılmış parazitleri, sünnet derisi fibroblastları ile önceden tohumlanmış 96 kuyulu bir mikroplakanın her kuyusuna aktarın ve mikroplakayı 7 gün boyunca 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle inkümal edin. Kuluçka sonunda, tek bir plak içeren kuyuları belirleyin ve 96 kuyulu mikroplaka kültürünün her kuyusundan yeniden askıya alınan Toksoplazma enfekte insan sünnet derisi fibroblastlarının 75 mikrolitresini tek tek 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Hücreleri santrifüj ile toplayın ve DNA salınım katkı sında seyreltme tamponu içeren 10.25 mikrolitre lysis tamponundaki peletleri yeniden askıya alın.
Daha sonra ilaç direnci kasetinin entegrasyonunu test etmek ve ilgi geninin kaybını test etmek için PCR'yi yapmadan önce numuneleri oda sıcaklığında dört dakika ve 98 santigrat derecede iki dakika kuluçkaya yatırın. Delta CPL suşlarındaki LHVS ve yabani tipin inhibisyonu, farklı inhibitör konsantrasyonlarına karşı luciferase aktivitelerinin çizilmesi yle belirlenebilir. PCR sonra, mutasyona uğramış plazmid doğrusalize edilir ve başarılı bir amplifikasyon doğrulaması için% 1 agarose jel içine yüklenir.
Jel ekstraksiyonu ve E.coli dönüşümünden sonra, beklenen plazmidleri içeren klonlar DNA diziliminde restriksiyon endokleaz sindirimi ile tarayabılabilir. Onarım şablonu amplifikasyonundan sonra, AGAROSE jel elektroforez pcr ürünün doğru boyutunu doğrulamak için kullanılabilir. Genellikle, yedi ila sekiz klonlar ilgi geninin kodlama dizisinin silinmesini kontrol etmek için ilk tarama için seçilir, ardından beş ve üç asal kol tespiti ile taranacak toplam klon sayısını en aza inmeye yardımcı olmak için.
Hedef proteini tanıyan herhangi bir antikor varsa immünoblotlama ile daha fazla doğrulama yapılabilir. Luciferase aktivite ölçümleri almadan önce, parazitlerin konak hücreleri tam olarak kontrol etmemeleri için sahte enfeksiyonlu net bir mikroplaka mikroskop altında kontrol edilmelidir.
