Ces stratégies sensibles peuvent être utilisées pour évaluer l’efficacité de l’inhibition des inhibiteurs chimiques et en combinaison avec la suppression du gène CRISPR-Cas9 pour étudier les cibles du médicament. Au lieu d’utiliser un test de point de terminaison, la croissance des parasites peut être surveillée au fil du temps pour permettre le calcul du temps de doublement des parasites à l’aide d’une protéine sensible reporter. Cet essai peut potentiellement être mis à l’échelle en 384 ou 1 536 microplaques de puits pour l’essai de composés multiples ou pour le criblage des bibliothèques d’une manière à haut débit.
Cette stratégie peut être modifiée pour quantifier la croissance d’autres agents pathogènes microbiens intracellulaires et leurs réponses au médicament d’intérêt. Pour effectuer un essai de croissance toxoplasma à base de luciferase, commencez par aspirer soigneusement le milieu des cultures microplaquées présemencées de 96 puits de fibroblastes de prépuce humaine et inoculez 150 microlitres de suspension parasite B dans les puits dans un format de trois colonnes cinq rangées. Après une incubation de quatre heures dans l’incubateur de culture cellulaire, aspirez soigneusement le milieu de chaque puits pour éliminer les parasites non envahis et remplir les puits dans chaque, mais la première rangée avec la température ambiante phénol rouge milieu libre.
Ajouter ensuite 100 microlitres d’une solution de substrat de luciferase de 12,5 micromolaires dans PBS dans chaque puits de la rangée supérieure et incuber les microplaques pendant 10 minutes à température ambiante pour permettre une lyse cellulaire complète. À la fin de l’incubation, mesurer l’activité de luciferase sur un lecteur de microplaques. Chaque lecture représente le nombre initial de parasites envahis à quatre heures après l’infection.
Répétez l’analyse toutes les 24 heures pendant les quatre prochains jours sans changer le milieu. Pour calculer le changement normalisé de la croissance des parasites, chaque lecture peut être divisée par la lecture initiale à quatre heures après l’infection. Le journal 2 du changement de pli normalisé de la croissance parasitaire peut alors être tracé contre chaque point de temps et soumis à une fonction de régression linéaire pour obtenir la pente qui représente le temps de doublement.
Pour évaluer l’efficacité de l’inhibition d’un composé d’intérêt sur la croissance de Toxoplasma, cultiver des fibroblastes de prépuce humaine dans des microplaques de 96 puits pendant au moins sept jours avant d’inoculer chaque puits de cellules avec 150 microlitres de parasites comme démontré pendant quatre heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pendant l’incubation, préparer le composé d’intérêt à huit concentrations différentes dans un réservoir de 12 puits par dilution en série. Diluer les composés dans un réservoir de 12 puits à une dilution d’un à trois par pipetting chaque mélange de haut en bas à plusieurs reprises avec une pipette d’un millilitre.
À quatre heures après l’infection, remplacer le milieu dans chaque puits à partir des colonnes deux à neuf avec 150 microlitres de milieu complété par chaque dilution du composé, laissant la première colonne remplie de milieu régulier pour servir de contrôle non traité. Ensuite, retournez les cultures cellulaires à l’incubateur de culture cellulaire pendant 96 heures et mesurez l’activité de luciferase pour chaque puits afin de déterminer le pourcentage d’inhibition de croissance dans les cultures à chaque concentration de composé. Pour calculer l’activité normalisée de luciferase en pourcentage, divisez l’activité moyenne de luciferase pour chaque concentration composée par l’activité moyenne de luciferase dérivée des parasites non traités.
Ensuite, utilisez un logiciel graphique approprié pour tracer les activités normalisées de luciferase contre le composé individuel et pour calculer la concentration inhibitrice demi-maximale pour chaque composé. Pour générer une construction plasmide exprimant l’ARN à guide unique et Cas9 pour la suppression d’un gène d’intérêt, naviguez vers la page ressources génomiques de Toxoplasma et récupérez l’ensemble de la séquence de codage génétique, y compris les introns et les exons, ainsi que les régions non traduites de 1,5 kilobase cinq et trois premières. Copiez la séquence TgCPL récupérée dans le logiciel d’analyse de séquence et étiquetez les cinq et trois premières régions non traduites.
Sur la page Ressources génomiques de Toxoplasma, cliquez sur Télécharger, Fichiers de données et Current_Release. Dans le dossier T.gondii GT1, sélectionnez FASTA. À partir du dossier de données, téléchargez le fichier séquence du génome de la souche Toxoplasma gondii GT1.
Créez ensuite un dossier local nommé Génome de Toxoplasma dans le logiciel d’analyse des séquences d’ADN et importez le fichier séquence du génome de Toxoplasma dans le dossier. Sélectionnez outils, clonage et trouver des sites CRISPR et définissez trois premiers cas9 pour l’emplacement du site PAM. Sélectionnez un ARN à guide unique qui démontre un score de spécificité élevé, généralement supérieur à 98% et n’a pas de G suivant le NGG.
L’ARN à guide unique sélectionné est habituellement situé à des sites proches du début et arrête les codons du gène d’intérêt. Utilisez ensuite un prémétrage PCR avec les paramètres indiqués dans le tableau pour effectuer une réaction PCR pour modifier le plasmide préexistant exprimant l’ARN à guide unique qui cible le gène TgUPRT. Pour la transfection de Toxoplasma, mélangez deux microgrammes d’ADN de modèle réparé avec 20 microgrammes des plasmides d’expression d’ARN Cas9 à guide unique et mélangez 400 microlitres de résuspension parasite, d’ADN et de cinq microlitres de 200 millimolaires ATP 500 millimolaires de glutathion réduite dans un tube centrifugeuse de 1,5 millilitre.
Ajouter le tampon de cytomix pour porter le volume total jusqu’à 500 microlitres au besoin et transférer le mélange d’ADN parasite à un espace de quatre millimètres avec cuvette d’électroporation. Puis électroporer les parasites à deux kilovolts et 50 ohms de résistance. Pour cloner les parasites knock-out, d’abord effectuer une dilution en deux étapes des parasites pour atteindre un 10 parasites par millilitre de D10 moyen complété par la concentration appropriée d’antibiotiques.
Ensuite, transférez 150 microlitres des parasites purifiés résuspendus à chaque puits d’une microplaque de 96 puits présemencée avec des fibroblastes de prépuce et incubez la microplaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant sept jours. À la fin de l’incubation, identifier les puits contenant une seule plaque et transférer 75 microlitres des fibroblastes humains en prépuce infectés par toxoplasma résuspendants de chaque puits de la culture microplaquée de 96 puits dans des tubes individuels de 1,5 millilitre. Recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre les granulés dans 10,25 microlitres de tampon de lyse contenant tampon de dilution dans l’additif de libération d’ADN.
Ensuite, incuber les échantillons pendant quatre minutes à température ambiante et deux minutes à 98 degrés Celsius avant d’effectuer pcr pour tester l’intégration de la cassette de résistance aux médicaments et la perte du gène d’intérêt. Les efficacités d’inhibition du LHVS et du type sauvage dans les souches delta CPL peuvent être déterminées en traçant leurs activités de luciferase contre différentes concentrations d’inhibiteurs. Après PCR, le plasmide muté est linéarisé et chargé dans un gel d’agarose de 1% pour la vérification d’une amplification réussie.
Après extraction de gel et transformation d’E.coli, les clones contenant les plasmides prévus peuvent être examinés par digestion d’endonuclease de restriction dans le séquençage d’ADN. Après amplification de modèle de réparation, l’électrophoresis de gel d’agarose peut être employé pour vérifier la taille correcte du produit de PCR. En général, sept à huit clones sont sélectionnés pour le dépistage initial afin de vérifier la suppression de la séquence de codage du gène d’intérêt, suivi de la détection des cinq et trois bras principaux pour aider à réduire au minimum le nombre total de clones à dépister.
D’autres vérifications peuvent être effectuées par immunoblotting si un anticorps reconnaissant la protéine cible est disponible. Avant d’obtenir des mesures de l’activité de la luciferase, une microplaque claire avec une infection simulée doit être vérifiée au microscope pour s’assurer que les parasites ne lysent pas complètement les cellules hôtes.
