这些敏感策略可用于评估化学抑制剂的抑制作用，并结合CRISPR-Cas9基因缺失来研究药物靶点。寄生虫生长可以随着时间的推移进行监测，而不是使用端点分析来监测，以便使用敏感的报告蛋白计算寄生虫加倍的时间。这种测定有可能在384或1，536孔微孔板中进行扩展，用于测试多种化合物或以高通量方式筛选库。
这一策略可以修改，以量化其他细胞内微生物病原体的生长及其对感兴趣的药物的反应。要进行基于荧光酶的弓形虫生长测定，首先从人类食金成纤维细胞的预种96孔微孔培养物中小心地吸出介质，然后以三列五行的形式将150微升寄生虫B悬浮液接种到井中。在细胞培养箱中孵育了四个小时后，小心地从每口井中吸出培养基，去除非侵入的寄生虫，并在每一排的孔中填充室温酚红色自由介质。
然后将 PBS 中 12.5 微摩尔荧光素酶基质溶液的 100 微升加入到顶排的每个孔中，并在室温下孵育微孔板 10 分钟，以进行全细胞解解。在孵育结束时，测量微孔板读卡器上的荧光素酶活性。每个读数表示感染后四小时入侵寄生虫的初始数量。
接下来的四天每 24 小时重复一次分析，而不更改介质。为了计算寄生虫生长的正常化折叠变化，每个读数可以除以感染后四小时的初始读数。然后，可以针对每个时间点绘制寄生虫生长的规范化折叠变化的对数 2，并受线性回归函数的影响，以获得表示加倍时间的斜率。
为了评估对弓形虫生长的一种感兴趣的化合物的抑制效果，在96孔微孔板中培养人类母体纤维细胞至少7天，然后接种每孔细胞，在37摄氏度和5%的二氧化碳下用150微升寄生虫接种4小时。在孵化过程中，通过连续稀释，在12井储液罐中以8种不同浓度准备兴趣化合物。通过用一毫升移液器上下移液数次，以一到三个稀释液稀释12井储液罐中的化合物。
感染后四小时，将每井中的介质从二柱到九柱中更换为150微升的介质，并辅以每次稀释的化合物，使第一柱充满常规介质，作为非处理控制。然后将细胞培养物返回到细胞培养箱96小时，并测量每一井的荧光酶活性，以确定每个化合物浓度的培养物中生长抑制的百分比。要将规范化的荧光素酶活性计算为百分比，请将每种化合物浓度的平均荧光素酶活性除以来自未处理寄生虫的平均荧光素酶活性。
然后使用适当的图形软件程序绘制针对单个化合物的规范化荧光素酶活性，并计算每种化合物的半最大值抑制浓度。要生成表示单导RNA和Cas9的质粒结构，用于删除感兴趣的基因，请导航到弓形虫基因组资源页面，并检索整个基因编码序列，包括内子和外子以及1.5千基5和三个主要未翻译区域。将检索到的 TgCPL 序列复制到序列分析软件中，并标记五个和三个未翻译的主要区域。
在弓形虫基因组资源页面上，单击"下载"、数据文件和Current_Release。在 T.gondii GT1 文件夹中，选择 FASTA。从数据文件夹中下载弓形虫贡迪GT1菌株基因组序列文件。
然后在DNA序列分析软件中创建名为"弓形虫基因组"的本地文件夹，并导入该文件夹中的弓形虫基因组序列文件。选择"工具"、克隆和查找 CRISPR 站点，为 PAM 站点位置设置三个主要 Cas9 黄金。选择显示高特异性分数的单导RNA，通常大于98%，并且NGG之后缺少G。
选定的单导RNA通常位于靠近感兴趣的基因的开始和停止的点。然后使用PCR预混料与表中所示的设置执行PCR反应，以修改预先存在的质粒表达针对TgUPRT基因的单导RNA。对于弓形虫转染，将两微克修复的模板DNA与20微克的单导RNA Cas9表达质粒混合，并在1.5毫升离心管中混合400微升寄生虫再吸附、脱氧核糖核酸和5微升200毫摩尔ATP 500毫摩尔减少谷胱甘肽。
添加细胞混合缓冲液，使总体积达到500微升根据需要，并转移寄生虫DNA混合物到四毫米的差距与电穿孔。然后以两千伏和50欧姆的电阻电分寄生虫。要克隆淘汰寄生虫，首先对寄生虫进行两步稀释，以达到每毫升D10介质10个寄生虫，并辅以适当的抗生素浓度。
接下来，将150微升的重新释放的纯化寄生虫转移到用爱皮成纤维细胞预种的96孔微孔板的每个孔井中，并在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育微孔板7天。在孵化结束时，识别含有单个斑块的井，从96孔微孔培养物的每个孔中将75个受重发的弓形虫感染的人类母金成纤维细胞的微升转移到单独的1.5毫升管中。通过离心收集细胞，并在含有脱氧核糖核酸释放添加剂中稀释缓冲液的10.25微升解液中重新填充细胞。
然后在室温下孵育样品4分钟，在98摄氏度下孵育2分钟，然后执行PCR测试耐药盒的整合和感兴趣的基因损失。LHVS和野生型在三角洲CPL菌株中的抑制功效可以通过绘制其针对不同抑制剂浓度的荧光素酶活性来确定。在PCR之后，电变质粒被线性化并加载到1%的加糖凝胶中，以验证成功的扩增。
在凝胶提取和大肠杆菌转化后，含有预期质粒的克隆可以通过DNA测序中的限制内核糖酶消化进行筛选。修复模板放大后，可以使用气糖凝胶电泳来验证PCR产品的正确尺寸。一般来说，在初始筛选中选择7至8个克隆，以检查有关基因编码序列的缺失，然后检测5个和3个主要臂，以帮助将要筛选的克隆总数降至最低。
如果有任何识别靶蛋白的抗体可用，可以通过免疫印迹完成进一步的验证。在获得荧光素酶活性测量之前，应在显微镜下检查具有模拟感染的透明微孔板，以确保寄生虫不会完全对宿主细胞进行欺骗。
