이러한 민감한 전략은 화학 억제제의 억제 효능을 평가하고 CRISPR-Cas9 유전자 삭제와 병용하여 약물 표적을 조사하는 데 사용될 수 있다. 끝점 분석기를 사용하는 대신, 기생충 성장은 민감한 리포터 단백질을 사용하여 기생충 두 배의 시간을 계산할 수 있도록 시간이 지남에 따라 모니터링될 수 있습니다. 이 분석체는 잠재적으로 다중 화합물의 시험을 위한 384 또는 1, 536 의 마이크로 플레이트또는 높은 처리량 방식으로 라이브러리의 선별을 위해 확장될 수 있다.
이 전략은 다른 세포 내 미생물 병원균의 성장과 관심있는 약물에 대한 반응을 정량화하기 위해 수정 될 수 있습니다. 루시파라제 기반 톡소플라즈마 성장 분석기를 수행하기 위해, 인간 포피섬유아세포의 96웰 마이크로플레이트 배양에서 배지를 주의 깊게 흡입하고 기생충 B 서스펜션 150마이크로리터를 3열-5열 형식으로 우물로 접종한다. 세포 배양 인큐베이터에서 4시간 배양 후, 각 우물에서 배지를 조심스럽게 흡습하여 비침략기생충을 제거하고 실온 페놀 레드 프리 배지로 첫 번째 행을 제외한 각 행의 우물을 채웁니다.
그런 다음 12.5 마이크로몰러 루시파라래이퍼 기판 용액100개를 상단 행의 각 웰에 추가하고 실온에서 10분 동안 마이크로플레이트를 배양하여 전체 셀 용해를 허용합니다. 인큐베이션이 끝나면 마이크로 플레이트 판독기에서 루시파라기 활동을 측정합니다. 각 독서는 감염 후 4 시간에서 침략한 기생충의 초기 수를 나타냅니다.
매체를 변경하지 않고 다음 4일 동안 24시간마다 분석을 반복합니다. 기생충 성장의 정규화된 접이식 변화를 계산하기 위하여는, 각 독서는 감염 후 4 시간에서 초기 독서로 나눌 수 있습니다. 기생충 성장의 정규화된 접이식 변화의 로그 2는 각 시점에 대해 플롯될 수 있으며, 이중 시간을 나타내는 경사를 얻기 위해 선형 회귀 기능을 실시할 수 있다.
Toxoplasma 성장에 대한 관심 화합물의 억제 효능을 평가하기 위해, 배양 인간 포피부 섬유아세포는 적어도 7일 동안 96웰 마이크로플레이트에서 각 우물을 접종하기 전에 기생충의 각 우물을 접종하기 전에 37°C와 이산화탄소 5%에서 4시간 동안 입증하였다. 인큐베이션 동안, 직렬 희석에 의해 12웰 저수지에서 8개의 다른 농도로 관심 있는 화합물을 준비한다. 1밀리리터 파이펫으로 각 혼합물을 여러 번 위아래로 피펫하여 1-3 희석에서 12웰 저장소에 화합물을 희석시 희석시.
감염 후 4시간 에서, 컬럼 2내지 9개에서 매립지의 매질을 150마이크로리터로 교체하여 화합물의 각 희석으로 보충하고, 첫 번째 컬럼을 일반 배지로 채워져 비처리 된 대조군으로 작용한다. 그런 다음 세포 배양을 세포 배양배기인큐베이터로 96시간 동안 반환하고 각 웰에 대한 루시파라제 활성을 측정하여 화합물의 각 농도에서 배양에서 성장 억제의 비율을 결정한다. 정규화된 루시파라제 활성을 백분율로 계산하려면, 비처리 기생충으로부터 유래된 평균 루시파아제 활성에 의해 각 화합물 농도에 대한 평균 루시파라제 활성을 나눕니다.
그런 다음 적절한 그래프 소프트웨어 프로그램을 사용하여 개별 화합물에 대한 정규화된 루시파라제 활동을 플롯하고 각 화합물에 대한 절반 최대 억제 농도를 계산한다. 관심 유전자를 삭제하기 위한 단일 가이드 RNA 및 Cas9을 발현하는 플라스미드 구조를 생성하기 위해 Toxoplasma 유전체학 자원 페이지로 이동하여 1.5킬로베이스 5 및 3개의 주요 번역되지 않은 영역과 함께 인트론 및 엑손을 포함한 전체 유전자 코딩 서열을 회수한다. 검색된 TgCPL 시퀀스를 시퀀스 분석 소프트웨어에 복사하고 5개 및 3개의 주요 번역되지 않은 영역에 레이블을 지정합니다.
Toxoplasma 유전체학 리소스 페이지에서 다운로드, 데이터 파일 및 Current_Release 클릭합니다. T.곤디 GT1 폴더에서 FASTA를 선택합니다. 데이터 폴더에서 톡소플라즈마 곤디 GT1 스트레인 게놈 서열 파일을 다운로드하십시오.
그런 다음 DNA 서열 분석 소프트웨어에서 Toxoplasma 게놈이라는 로컬 폴더를 만들고 Toxoplasma 게놈 서열 파일을 폴더로 가져옵니다. 도구, 복제 및 CRISPR 사이트 찾기를 선택하고 PAM 사이트 위치에 대한 세 가지 프라임 Cas9 프라임을 설정합니다. 일반적으로 98%보다 크고 NGG 다음에 G가 부족한 높은 특이성 점수를 보여주는 단일 가이드 RNA를 선택한다.
선택된 단하나 가이드 RNA는 일반적으로 관심 있는 유전자의 시작 및 정지 코돈에 가까운 사이트에 위치합니다. 그런 다음 표에 표시된 대로 설정과 PCR 프리믹스를 사용하여 TgUPRT 유전자를 표적으로 하는 단일 가이드 RNA를 발현하는 기존의 플라스미드를 수정하는 PCR 반응을 수행한다. Toxoplasma 트랜스펙션의 경우, 수리된 템플릿 DNA 20 마이크로그램과 단일 가이드 RNA Cas9 발현 플라스미드20 마이크로리터를 혼합하고 기생충 리서스펜션, DNA 및 200 밀리머 ATP 500 밀리머라 감소글루타티온을 1.5밀리리터 센트리슈에 혼합합니다.
시토믹스 버퍼를 추가하여 필요에 따라 총 부피500 마이크로리터를 가져와 기생충 DNA 혼합물을 전기 기화 큐벳과 4밀리미터 간격으로 전달합니다. 그런 다음 기생충을 2 킬로볼트와 50 옴의 저항에서 전기화합니다. 녹아웃 기생충을 복제하기 위해 먼저 기생충의 2 단계 희석을 수행하여 적절한 항생제 농도로 보충된 D10 배지의 밀리리터 당 10개의 기생충을 달성한다.
다음으로, 150마이크로리터의 정제된 기생충을 포피부 섬유아로 미리 시드한 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 옮기고 7일 동안 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 마이크로플레이트를 배양한다. 인큐베이션의 끝에서, 단일 플라크를 포함하는 우물을 식별하고 개별 1.5 밀리리터 튜브로 96 웰마이크로 플레이트 배양의 각 우물에서 재중단 톡소 플라즈마 감염된 인간의 포피 카포아세포의 75 마이크로 리터를 전송. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 DNA 방출 첨가제에서 희석 버퍼를 함유하는 용해 버퍼의 10.25 마이크로리터에서 펠릿을 재연한다.
그런 다음 실온에서 4분, 섭씨 98도에서 2분 동안 샘플을 배양한 후 PCR을 수행하여 약물 내성 카세트의 통합과 관심 유전자의 손실을 테스트한다. 델타 CPL 균주의 LHVS 및 야생 유형의 억제 효능은 다른 억제제 농도에 대한 루시파아제 활동을 플로팅하여 결정할 수 있다. PCR 후, 돌연변이 플라스미드는 선형화되어 성공적인 증폭을 검증하기 위해 1%아가로즈 젤에 적재됩니다.
젤 추출 및 대장균 변환 후, 예상 플라스미드를 함유한 클론은 DNA 염기서열 분석에서 제한 엔도누클로스 소화에 의해 스크리닝될 수 있다. 수리 템플릿 증폭 후, 아가로즈 젤 전기포고를 사용하여 PCR 제품의 정확한 크기를 확인할 수 있다. 일반적으로, 7~8개의 클론은 관심 있는 유전자의 코딩 서열의 삭제를 확인하기 위해 초기 스크리닝을 위해 선택되고, 그 다음으로 5및 3개의 프라임 암의 검출을 통해 총 클론 수를 최소화하여 선별할 수 있다.
표적 단백질을 인식하는 항체가 가능한 경우 면역 블로팅에 의해 추가 검증이 완료될 수 있다. 루시파라제 활동 측정을 얻기 전에, 모의 감염이 있는 명확한 마이크로플레이트는 기생충이 숙주 세포를 완전히 lyse하지 않도록 현미경으로 검사되어야 합니다.
