これらの高感度戦略は、化学物質阻害剤の阻害効果を評価するために使用することができ、CRISPR-Cas9遺伝子欠失と組み合わせて薬物標的を調査することができます。エンドポイントアッセイを使用する代わりに、経時に寄生虫の成長を監視して、感受性レポータータンパク質を使用して寄生虫の倍増時間の計算を可能にすることができます。このアッセイは、複数の化合物の試験や高スループット方式でのライブラリのスクリーニングのために、384または1、536ウェルマイクロプレートにスケールアップできる可能性があります。
この戦略は、他の細胞内微生物病原体の成長と関心のある薬物に対するそれらの反応を定量化するために変更することができます。ルシファーゼベースのトキソプラズマ増殖アッセイを行うために、ヒト包皮線維芽細胞の前播種96ウェルマイクロプレート培養物から培地を注意深く吸着し、150マイクロリットルの寄生虫B懸濁液を3列5列形式でウェルに接種することから始める。細胞培養インキュベーターで4時間のインキュベーションの後、各ウェルから慎重に吸引して非侵入性寄生虫を除去し、室温フェノール赤色フリー培地を含む最初の行のウェルを充填する。
その後、PBSの12.5マイクロモルルシメラーゼ基質溶液の100マイクロリットルを上段の各ウェルに加え、マイクロプレートを室温で10分間インキュベートして完全な細胞溶解を可能にします。インキュベーションの終了時に、マイクロプレートリーダー上のルシファーゼ活性を測定する。各読み取り値は、感染後4時間で侵入した寄生虫の初期数を表します。
培地を変更せずに、次の4日間、24時間ごとに分析を繰り返します。寄生虫の成長の正規化された折り畳み変化を計算するために、各測定値を感染後4時間の最初の読み取り値で割ることができる。そして、準サイト成長の正規化されたフォールド変化の対数2を各時点に対してプロットし、線形回帰関数に供し、倍倍時間を表す傾きを求めることができる。
トキソプラズマの成長に関心のある化合物の阻害の有効性を評価するために、ヒト包皮線維芽細胞を96ウェルマイクロプレートで少なくとも7日間培養してから、摂氏37度と5%の二酸化炭素で4時間実証したように、150マイクロリットルの寄生虫を有する細胞の各井戸を接種した。インキュベーション中、連続希釈により12ウェル貯留槽内の8つの異なる濃度で目的の化合物を調製する。1~3の希釈液で12ウェルのリザーバで化合物を希釈し、各混合物を1ミリリットルのピペットで数回上下にピペット化します。
感染後4時間で、2~9列目の各ウェルの培地を、化合物の希釈ごとに150マイクロリットルの培地を補充し、第1列を通常の培地で満たして非治療対照として機能させる。次いで、細胞培養液を培養インキュベーターに96時間戻し、各ウェルのルシファーゼ活性を測定し、各濃度の化合物における培養における増殖阻害の割合を決定する。正規化されたルシファーゼ活性をパーセントで計算するには、各化合物濃度の平均ルシファーゼ活性を非処理パラサイトに由来する平均ルシファーゼ活性で割る。
次に、適切なグラフ化ソフトウェアプログラムを使用して、個々の化合物に対する正規化されたルシファーゼーゼ活性をプロットし、各化合物の半分の最大阻害濃度を計算します。目的の遺伝子を削除するためのシングルガイドRNAとCas9を発現するプラスミド構築物を生成するには、トキソプラズマゲノミクスリソースページに移動し、1.5キロベース5および3つの素数未翻訳領域とともにイントロンおよびエキソンを含む遺伝子コード配列全体を取得します。取得した TgCPL シーケンスをシーケンス解析ソフトウェアにコピーし、5 個の主要な未変換領域と 3 つの主要領域にラベルを付けます。
トキソプラズマゲノミクスリソースページで、ダウンロード、データファイル、Current_Releaseをクリックします。T.gondii GT1 フォルダーで、[FASTA] を選択します。データフォルダから、トキソプラズマゴンディGT1株ゲノム配列ファイルをダウンロードします。
次に、DNA配列解析ソフトウェアにトキソプラズマゲノムという名前のローカルフォルダを作成し、トキソプラズマゲノム配列ファイルをフォルダにインポートします。[ツール]、[クローニング]、[CRISPR サイトの検索] を選択し、PAM サイトの場所に 3 つの素数 Cas9 プライムを設定します。高い特異性スコアを示すシングルガイドRNAを選択し、一般的に98%を超え、NGGに続くGを欠きます。
選択された単一ガイドRNAは、通常、対象遺伝子の開始および停止コドンに近い部位に位置する。次に、表に示された設定で PCR プレミックスを使用して PCR 反応を行い、TgUPRT 遺伝子を標的とする単一ガイド RNA を発現する既存のプラスミドを修飾します。トキソプラズマトランスフェクションの場合、修復されたテンプレートDNAを2マイクログラムのシングルガイドRNA Cas9発現プラスミドと混合し、400マイクロリットルの寄生虫リセウ、DNA、および200ミリモルATP 500ミリモル還元グルタチオン500ミリモル還元グルタチオンを1.5ミリリットルの遠心管に混ぜます。
サイトミックスバッファーを追加して、必要に応じて最大 500 マイクロリットルの総容量を持ち、エレクトロポレーションキュベットで 4 ミリの隙間に寄生虫 DNA 混合物を転送します。その後、2キロボルトと抵抗の50オームで寄生虫を電気ポレートします。ノックアウト寄生虫をクローン化するには、まず、適切な抗生物質濃度を添加したD10培地の1ミリリットル当たり10個の寄生虫を達成するために寄生虫の2段階希釈を行う。
次に、再懸濁精製された寄生虫150マイクロリットルを包皮線維芽細胞で前播種した96ウェルマイクロプレートの各ウェルに移し、マイクロプレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素を7日間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、単一のプラークを含むウェルを特定し、再懸濁したトキソプラズマ感染ヒト包皮線維芽細胞の75マイクロリットルを、96ウェルマイクロプレート培養物の各ウェルから個々の1.5ミリリットルのチューブに移す。遠心分離によって細胞を収集し、DNA放出添加剤中の希釈バッファーを含む溶解バッファーの10.25マイクロリットルでペレットを再懸濁します。
次に、PCRを実行する前に、室温で4分間、摂氏98度で2分間インキュベートし、薬剤耐性カセットの統合と目的の遺伝子の損失をテストします。デルタCPL株におけるLHVSおよび野生型の阻害効果は、異なる阻害剤濃度に対するそれらのルシファーゼ活性をプロットすることによって決定することができる。PCR後、変異したプラスミドを線形化し、1%アガロースゲルにロードして、増幅が成功したことを検証します。
ゲル抽出および大腸菌変換後、期待されるプラスミドを含むクローンを、DNAシーケンシングにおける制限エンドヌクレアーゼ消化によってスクリーニングすることができる。修復テンプレート増幅後、アガロースゲル電気泳動を使用して、PCR産物の正しいサイズを確認することができます。一般的に、対象遺伝子のコード配列の欠失をチェックするための初期スクリーニングには7~8個のクローンが選択され、その後にスクリーニングされるクローンの総数を最小限に抑えるために5本および3本の素腕を検出する。
さらに、標的タンパク質を認識する抗体が利用可能であれば免疫ブロッティングにより、さらなる検証を完了することができる。ルシファーゼ活性測定を得る前に、模擬感染を伴う透明なマイクロプレートを顕微鏡でチェックし、寄生虫が宿主細胞を完全にライゼしていないことを確認する必要があります。
