Ce protocole permet d’évaluer les altérations morphologiques potentielles des neurones et des épines dendritiques qui peuvent souligner les anomalies neurochimiques et comportementales. Il est unique et utile pour visualiser les neurones dans différentes régions du cerveau chez les rats, ce qui, en combinaison avec un logiciel de reconstruction sophistiqué permet aux chercheurs d’élucider les mécanismes possibles sous-jacents au dysfonctionnement neurocognitif. Commencez par préparer la solution PVP selon les directives manuscrites.
Remplissez le tube de PVP et laissez-le pendant 20 minutes. Et l’expulser à travers l’autre bout avec une seringue de 10 millilitres. Mélanger 170 milligrammes de perles de microcarrier de tungstène avec 250 microlitres de chlorure de méthylène.
Puis bien vortex de la suspension. Ensuite, ajoutez 6 milligrammes de colorant lipophile DilC18(3) à 300 microlitres de chlorure de méthylène et de vortex. Pipet 250 microlitres de la suspension de perle de tungstène sur une glissière en verre.
Attendez que la suspension sèche à l’air libre et ajoutez 300 microlitres de la solution de teinture. Une fois séché, utiliser un rasoir pour diviser le mélange en deux tubes centrifugeuses de 1,5 millilitre et remplir les tubes d’eau. Sonicate le mélange dans un bain d’eau jusqu’à homogénéité.
S’assurer que la pointe du sonicateur se trouve directement sur les tubes. Dans un tube conique de 15 millilitres, mélanger les deux mélanges. Et sonicate pendant encore trois minutes, en s’assurant qu’il ne reste pas de grandes touffes de perles enduites de teinture.
Après la sonication, dessiner le mélange dans le tube enduit PVP avec une seringue de 10 millilitres. Et nourrir le tube dans la station de préparation. Faites pivoter le tube pendant une minute.
Retirer soigneusement toute l’eau à l’aide d’une seringue. Allumez le gaz azoté et ajustez le débit d’azote à environ 0,5 litres par minute. Faites pivoter le tube dans la station de préparation et séchez-le avec de l’azote pendant 30 minutes.
Retirez le tube de la station et coupez-le en segments de 13 millimètres à l’aide d’un coupe-tube. Assurez-vous que le rat n’est pas sensible aux stimuli nocifs et les réflexes sont absents. Ensuite, fixez-le dans la position supine.
Faire une incision le long de la ligne médiane thoracique. Séparez le diaphragme et ouvrez la poitrine avec des ciseaux. Insérez ensuite une aiguille de 20 jauges de 25 millimètres dans le ventricule gauche.
Coupez immédiatement l’atrium droit avec des ciseaux et perfusez 15 millilitres de PBS de 100 millimolaires avec un débit de 5 millimètres par minute. Puis parcourir 100 millilitres de 4%PFA tamponné en PBS. Après la perfusion, retirez tout le cerveau du rat.
Et postfix il avec 4%PFA pendant 10 minutes. Utilisez une matrice cérébrale de rat pour couper 500 micromètres d’épaisseur section coronale. Faire une coupe de poing et garder la lame en place.
Ensuite, faites une deuxième coupe avec une deuxième lame et retirez verticalement la première lame, en gardant le tissu sur la surface de la lame. Placez les tranches de cerveau dans la plaque de 24 puits avec 1 millilitre de PBS dans chaque puits. Et répétez le processus jusqu’à ce que toutes les tranches aient été coupées.
Retirez le PBS de chaque puits ciblé. Chargez le cartilage avec un morceau de tube de dil/tungstène et placez-le dans l’applicateur. Mettez un morceau de papier filtre entre les deux écrans de maille.
Et connectez l’applicateur au tuyau d’hélium. Réglez ensuite la pression de sortie de l’hélium à 90 livres par pouce carré. Placez l’applicateur verticalement au centre du puits ciblé de 1,5 centimètre entre l’échantillon et l’écran en maille.
Puis tirez sur le tube de dil/tungstène. Chargez le cartilage avec le tube suivant et tirez continuellement les perles du tube sur les tranches restantes. Remplissez la plaque de 24 puits avec 100 millimolar PBS.
Et laver les tranches trois fois avec 500 microlitres de PBS frais. S’assurer que les tranches ne se retournent pas pendant le lavage. Une fois terminé, ajouter 500 microlitres de PBS frais aux tranches.
Et les incuber pendant trois heures à quatre degrés Celsius dans le noir. Après l’incubation, utiliser une brosse fine pour transférer les tranches de cerveau sur des toboggans en verre. Et ajoutez immédiatement un millilitre de support de montage antifade à chaque section.
Placez un coverslip de 22 par 15 millimètres sur les sections et séchez les glissières dans l’obscurité. Allumez le système de microscope confocal et passez à un objectif 60X. Ajustez les paramètres d’imagerie en fonction des instructions manuscrites.
Et obtenir des images Z-stack pour le type de neurone ciblé basé sur les limites de la région du cerveau et les caractéristiques morphologiques des neurones. Isoler le neurone cortical primaire des rats F344/N au premier jour postnatal et les culture dans un plat de fond en verre de 35 millimètres pendant une semaine. Rafraîchissant la moitié du milieu le troisième jour après l’isolement.
Lavez le plat deux fois avec 1 millilitre de 100 millimolar PBS. Et fixer les cellules avec 4%PFA pendant 15 minutes à température ambiante. Étiquetez balistiquement les cellules comme précédemment décrites.
Et lavez-les trois fois de plus avec 1 millilitre de PBS. Ajouter 500 microlitres de PBS aux cellules et les incuber pendant trois heures à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Ajouter ensuite 200 microlitres de milieu de montage antifade.
Et obtenez des images Z-stack pour chaque neurone ciblé. Les neurones pyramidaux typiques dans la région hippocampale dans les sections de cerveau de rat ont été identifiés avec la technologie d’étiquetage balistique caractérisée par un grand dendrite apical et plusieurs dendrites basiques plus petits autour du soma. Le logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale a été utilisé pour tracer les branches dendritiques et détecter les épines.
Par la suite, le logiciel a été utilisé pour évaluer la complexité des ramifications dendritiques et la complexité neuronale des arbres. Des changements morphologiques dans des épines dendritiques ont été évalués utilisant la longueur, le volume, et le diamètre de tête. Puis les épines ont été classées en épines minces, stubby, et champignons.
Et la fréquence relative du nombre d’épines entre chaque rayon a été examinée. En outre, la technique d’étiquetage balistique a été validée sur un neurone pyramidal primaire dans la culture cellulaire. Des neurones pyramidaux ont été identifiés basés sur la forme de triangle du soma et le grand dendrite apical.
Puis le logiciel de reconstruction neuronale a été utilisé pour analyser la distribution des épines dendritiques minces et de la longueur de la colonne vertébrale dendritique. Lorsque vous essayez ce protocole, il est important d’éviter de grandes touffes ou des grappes de perles de tungstène enduites de colorant balistique qui commencent la préparation. Les touffes ne permettraient pas de distinguer les neurones individuels.
Combinée à un logiciel de reconstruction neuronale, cette méthode nous permet d’examiner la morphologie neuronale et dendritique de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux hippocampiques. Le logiciel de reconstruction neuronale utilise un algorithme pour offrir la classification assistée automatique des épines dendritiques. La quantification de paramètres neuronaux multiples offre l’occasion de mieux comprendre le mécanisme sous-jacent au dysfonctionnement cognitif neuronal.
