نود أن نشكر يعقوب سوليس على مساعدته في تحرير الفيديو. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من جائزة CAREER NSF-0953902 DBI ليفين MJ.

1. الإرواء (5) والجامع الحيوانية المقاصة مخ الفأر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن على طول الإجراء تختلف تبعا لطول الفترة الزمنية المستخدمة في الخطوة الجفاف، ولكن في المجموع يمكن أن تجرى العملية برمتها في غضون يومين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن الفئران YFP ثم تخدير عميق مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين / زيلازين (100 ملغ / كغ: 10 مغ / كغ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد طائرة الجراحية التخدير العميق قبل الشروع في عملية جراحية. تحقق من كل الحيوانات 5 دقائق لمعرفة ما اذا كان يتفاعل مع شركة في احد اصابع القدم أو قرصة الذيل. إذا كان الحيوان يتفاعل، لا بد من جرعة تكميلية (1/3 من الجرعة الأصلية) من الكيتامين / زيلازين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تخدير عميق، كبح جماح الماوس من خلال الالتزام كل الأطراف إلى سرير الجراحية باستخدام الشريط المختبر بحيث الماوس في موقف ضعيف (recumbancy الظهرية)، وفضح صدره لعملية جراحية. يتم عادة السرير الجراحي للمعدن أو شبكة بلاستيكية ووضعها في الحوض أو على رأس عموم الشفاه بحيث الدم ومثبتيمكنك بسهولة أن تجمع النفايات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتبدأ، دون إجراء شق عملية سيفي الشكل. قطع على طول قاعدة القفص الصدري باستخدام مقص وملاقط وسحب الجلد، حيث يتم إجراء خفض الانتاج. جعل اثنين تخفيضات على طول جانبي القص الماوس (عن طريق الأضلاع) لإنشاء رفرف من الأنسجة التي تعقد بعيدا عن تجويف الصدر باستخدام مرقئ لمغادرة القلب عرضة للخطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة الى وجود إبرة ز 23 إلى البطين الأيسر من القلب، وجعل شق صغير في جدار عضلة الأذين الأيمن للسماح الدم من الفرار. يرجى الرجوع إلى المادة إن الرب 2497 للحصول على فيديو من هذا الإجراء .. 5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد قطع الأذين الأيمن، يبدأ نضح مع 4 ° C مخزنة المالحة الفوسفات، PBS، (الرقم الهيدروجيني 7.2) حتى لم يعد لاحظ الدم استنزاف من الأذين الأيمن للقلب (30 - 40 مل بمعدل حوالي 5 مل / دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم استنزاف كل الدم (السائل الخروج من الأذين الأيمن واضح)، والتبديل وسيلة التروية إلى 4٪ المبردةPFA حل. يروي الجسم حتى الماوس، يصبح صلبا بشكل ملحوظ والباردة لمسة (حوالي 30 حتي 40 مل بمعدل حوالي 5 مل / دقيقة). (يتم تخفيف المركزة حل PFA 16٪ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ويتم إضافة هيدروكسيد الصوديوم حتى يتم التوصل درجة الحموضة 7.2. ارتداء قفازات ومعطف المختبر والتعامل مع المواد الكيميائية وتخلط داخل غطاء الدخان.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نضح، إزالة الماوس من السرير الجراحية وقطع رأس لبدء استئصال الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط ومقص القزحية، وإزالة أجزاء صغيرة في الجمجمة بدءا من الجزء الخلفي من الجمجمة والمضي قدما. إجراء تخفيضات صغيرة كل 2 - 4 مم مع مقص عبر الجمجمة أثناء استخدام الملقط لسحب العظام بعناية بعيدا عن الدماغ في أجزاء صغيرة. القيام بذلك حتى يتم كشف كامل السطح العلوي من الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئصال الدماغ من الجمجمة باستخدام مم 5 اسعة، ملعقة مسطحة ومكان إلى قارورة زجاجية. يغرق في PFA 4٪ لمدة 6 ساعة في 4 درجات مئوية لمدة تثبيت آخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد آخرتثبيت، وغسل الدماغ مرتين في درجة حرارة الغرفة قبل صب PBS PFA من القارورة الزجاجية واستبدالها PBS. دوامة الدماغ في حل PBS قبل صب بها واستبدال مع PBS لغسل الثاني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى الدماغ في درجة حرارة الغرفة من خلال سلسلة متدرجة من الايثانول حضانات (مرة واحدة في 50٪، 70٪، 95٪، و٪ في مرتين 100) في 2 ساعة في الحضانة، ثم 12 ساعة لحضانة 2 الإيثانول بنسبة 100٪، ل استخراج المياه من أنسجة الثابتة. لكل الحضانة، من اجل الخروج الحل الايثانول السابقة من القارورة الزجاجية واستبدالها الحل لاحقة حتى يتم مغمورة تماما الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة الثانية في الإيثانول بنسبة 100٪، من اجل الخروج واستبدال الحل مع الإيثانول أجزاء متساوية والحل المقاصة التي تحتوي على كحول البنزيل بنزوات البنزيل و(1:2 المجلد: المجلد نسبة). بعد 2 ساعة من، حضانة حل هذا صب واستبدالها مع حل 100٪ من الكحول البنزيل بنزوات البنزيل و(1:2 المجلد: المجلد نسبة). وrefraمؤشر التفاعلية الذي نظمه من الحل المقاصة هو ن = 1.54. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في BABB، سوف تصبح شفافة الدماغ بشكل ملحوظ، في غضون 4-5 ساعة. لأفضل النتائج المقاصة، وترك لمسح الدماغ لمدة 6 أيام في درجة حرارة الغرفة في حين محمية من الضوء الساطع. </li></ol> 2. المجهر الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم مسح الدماغ وجاهزة للتصوير، اللاحقه إلى الجزء السفلي من طبق بيتري باستخدام CYANOACRYLATE. السماح لاصقة لتجف قبل المتابعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التجفيف، يغرق في الدماغ BABB ووضع طبق بتري تحت المجهر الهدف للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم المجهر multiphoton أن يتضمن تاي ماي الليزر الياقوت التيتانيوم قابل للتعديل بين 710-990 نانومتر نانومتر الطول الموجي الإثارة. الطول الموجي الإثارة التي نستخدمها لتوليد إشارات YFP هو 886 نانومتر. الليزر السلطة يختلف 30 حتي 100 ميغاواط اعتمادا على عمق التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط اشارة تعكس الفلورسنت باستخدام نيكون الهدف 5X (NA، 0.5) الذي يسمح لكبيرمجال للرؤية والتصوير (2 × 2 ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية إشارة تعكس الفلورسنت باستخدام فلتر 535/50 وممر الموجة أنه جمع باستخدام PMT GaAsP (H7422PA-40، هاماماتسو، بريدجووتر، نيو جيرسي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صور العملية باستخدام برمجيات ScanImage 6 في قرار من 2048 بكسل 2048 × باستخدام معدل مسح من 2 مللي خط في لتوليد عالية الدقة والصور YFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة التصوير اكتمال إزالة الدماغ من طبق بتري باستخدام ملقط وتخزينها في BABB محمية من الضوء للتصوير في المستقبل. للعينات لصقها، وإزالة الأنسجة عن طريق تشغيل شفرة حلاقة بين الغراء وطبق بتري بزاوية أكبر من 30 درجة لا. نحن بتخزينها في عينات BABB لمدة تصل إلى 1 سنة مع أي تدهور مرئية. </li></ol> 3. ممثل النتائج الصور ومقاطع الفيديو ممثل المعروضة هنا تظهر قدرة عالية الدقة التصوير multiphoton بفضل تبادل المعلومات البصرية. تصوير الدماغ كله يسمحلYFP التي تحمل علامات الخلايا العصبية في طبقات مختلفة من الحصين والقشرة لتكون مرئية بوضوح على عمق 2 ملم تحت سطح الأنسجة. ويظهر الشكل 1 صورة ممثل وجهة نظر الاكليلية الموافق الميزات التشريحية للقرن آمون في 2،92 مم الذيلية لbregma 7. كان عمق التصوير في العينة 1،94 مم. وكان بعض هذا الاختلاف يرجع إلى إزالة المخيخ في نهاية الذيلية من الدماغ وكان التوازن بسبب الانكماش من عملية الجفاف. صورة أخرى من المكدس يظهر طبقة V / VI الخلايا العصبية الهرمية من القشرة المخية الحديثة معربا عن YFP 2 مم تحت سطح النسيج (الشكل 2). تم الحصول عليها باستخدام جميع الصور تم الهدف نيكون التكبير 5X وباستخدام ميزة تقريب رقمي للصورة في اقتناء البرمجيات ScanImage. من يركز اهتمامه على القشرة المخية الحديثة، ومحاور عصبية فردية وأجسام الخلايا العصبية من الخلايا العصبية الهرمية في V طبقة من القشرة المخية الحديثة واضحةلاي مميزة تصل إلى 1.02 ملم تحت سطح الأنسجة (الشكل 3). باستخدام كومة من الصور الشكل 3، قدم التعمير 3D من الخلايا العصبية في المنطقة باستخدام البرمجيات يماغيج 8 (الشكل 4). القدرة عالية الدقة من MPM كما يسمح لنا لتقديم صور من الخلايا العصبية، كاملة الفردية. هنا نعرض لإعادة بناء الخلايا العصبية الهرمية طبقة من القشرة المخية الحديثة V في العمليات التي شجيري الفردية واضحة للعيان (الشكل 5). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig1.jpg" /> الشكل 1 صورة الممثل كومة من الصور 1.2 مم (0.8 - 2 مم تحت سطح الأنسجة). من مخ الفأر كله تظهر القشرة المخية الحديثة وطبقات مختلفة من قرن آمون. ملامح قرن آمون مرئية 1.1 مم تحت سطح الأنسجة ووقد وصفت باستخدام متابعةجي رمز: DG = التلفيف المسنن، GrDG = طبقة الحبيبية من DG، Lmol = الجوبية الجزيئية طبقة، الطبقة الجزيئية مول = DG، أو طبقة المتجهة =، = PoDG المفصصة طبقة DG، PY = طبقة الخلايا الهرمية، راد = الطبقة المشععة 7 الصورة هو 1.8 × 1.8 ملم في الحجم والنطاق بار = 200 ميكرومتر. تم اضافته في نهاية منقاري من الدماغ إلى طبق بتري مع نهاية الذيلية مواجهة نحو الهدف. هذا سهل التصوير في الطائرة الاكليلية. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig2.jpg" /> الشكل 2 الإطار الممثل من المكدس مم الصورة 1.2 (0.8 - 2 مم تحت سطح الأنسجة). من مخ الفأر كله تسليط الضوء على القشرة المخية الحديثة. الخلايا الهرمية والعمليات معربا عن YFP في طبقة V / VI من القشرة واضحة 2 مم تحت سطح الأنسجة. درجة العلامات يتفق مع التقارير السابقة للوضع العلامات متفرق في القشرة المخية الحديثة. يتم تكبير 9 أقحم (يمين) من ب<html> oxed المنطقة على اليسار. الصورة هو 1.8 × 1.8 ملم في الحجم والنطاق بار = 200 ميكرومتر (50 ميكرومتر الشكل). <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig3.jpg" /> الشكل 3. الإطار الممثل المتخذة 774 ميكرومتر تحت سطح الأنسجة من المكدس صورة الخلايا العصبية الهرمية في الطبقة V القشرة المخية الحديثة من الدماغ. كومة من 700 ميكرومتر يذهب إلى 1،020 ميكرومتر تحت سطح الأنسجة. تم استخدام تقريب رقمي 8x لالتقاط تفاصيل مثل العمليات الدقيقة. صورة هو 225 × 225 ميكرون في الحجم، حجم شريط = 20 ميكرومتر. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig4.jpg" /> الشكل 4. صورة الممثل إعادة الإعمار 3D (225 × 225 × 320 ميكرون) من المكدس الصورة في الشكل 3. صورة هو 225 × 225 ميكرون في الحجم، حجم شريط = 28 ميكرومتر. S &quot;&gt; <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig5.jpg" /> الشكل 5. صورة عالية الدقة أعيد بناؤها من الخلايا العصبية الهرمية طبقة من القشرة المخية الحديثة V باستخدام تكبير 10X الرقمية. الخلايا العصبية يقيس 485 ميكرومتر في الطول، الحجم = 25 بار ميكرومتر. مجال الرؤية لكل البلاط صورة هو 180 × 180 ميكرومتر ميكرومتر. كل البلاط هو على عمق مختلفة (ض المستوى). والتشعبات القشرية قمي لا، بصفة عامة، YFP صريحة وكذلك في سوما. أن يكون كل من في نفس المجال للعرض، كما هو موضح هنا، تم تخفيض القدرة على تقليل تشبع سوما، وهذا يجعل من نظرة عملية غرامة باهتة. كان تركيزنا هنا على إثبات مجال للرؤية بدلا من التفاصيل الدقيقة. للكشف عن التفاصيل الدقيقة، واستخدام الزوم الرقمي، والتركيز على منطقة دون سوما، وزيادة قوة الليزر.

<ol>
	<li>Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+organs.">Multiphoton microscopy of cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).</li><li>Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence,+second+harmonic+generation,+and+fluorescence+lifetime+imaging+of+whole+cleared+mouse+organs.">Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).</li><li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+insect+and+mammalian+embryo+imaging+with+confocal+microscopy:+Morphology+and+apoptosis.">Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis.</a> Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).</li><li>Sakhalkar, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+in+bulk+tissue+specimens+using+optical+emission+tomography:+Fluorescence+preservation+during+optical+clearing.">Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing.</a> Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).</li><li>Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-mouse+Neuroanatomical+Magnetic+Resonance+Imaging.">Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging.</a> J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 2, (2003).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Hama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).</li></ol>

أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها العناية جامعة ييل الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام.

بينما الأصباغ العضوية القياسية متوافقة مع مجموعة من المذيبات العضوية، وبالتالي لا تشكل تحديا خاصا لتطهير البروتوكولات والبروتينات الفلورية وغالبا ما تكون أقل تسامحا من التغييرات في المذيبات .. 4 والهدف من هذا العمل هو التغلب قيدا خطيرا من البروتوكولات السابق?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> التخزين المؤقت المالحة الفوسفات </td><td> سيغما الدريخ، وشركة </td><td> D8537 </td><td> 500 مل، ودرجة الحموضة 7.2 </td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> 15710 </td><td> 10 × 10 مل، 16٪ بارافورمالدهيد </td></tr><tr><td> الكحول الإيثيلي </td><td> Bioanalytical الأمريكية </td><td> AB00515-00500 </td><td> 500 مل، 200 دليلا </td></tr><tr><td> الكحول الإيثيلي </td><td> Pharmco المنتجات، وشركة </td><td> 111000190 </td><td> 1 غال.، 190 دليلا </td></tr><tr><td> البنزيل الكحول </td><td> سيغما الدريخ، وشركة </td><td> 402834 </td><td> 500 مل، 99 +٪ </td></tr><tr><td> بنزيل بنزوات </td><td> سيغما الدريخ، وشركة </td><td> B6630-IL </td><td> 500 مل، ≥ 99٪ </td></tr><tr><td> 5X/0.5 NA الهدف </td><td> نيكون </td><td> AZ الدقيق خطة 5X </td><td> 15 WD </td></tr></tbody></table>

multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing yfp

يتم توليد المجهر Multiphoton الجوهرية التوافقي مضان والثانية (SHG) من أجهزة الماوس كله ممكن عن طريق مسح ضوئيا الجهاز قبل التصوير. 1،2 ومع ذلك، لأجهزة التي تحتوي على البروتينات الفلورية مثل GFP وYFP، وبروتوكولات تبادل المعلومات البصرية التي تستخدم الميثانول الجفاف واضحة باستخدام كحول البنزيل: بنزيل بنزوات (BABB)، في حين دون وقاية من 3 ضوء لا تحتفظ إشارة الفلورسنت. بروتوكول المعروضة هنا هي طريقة الرواية التي لأداء الجهاز كله المقاصة الضوئية على مخ الفأر مع الحفاظ على إشارة مضان من الخلايا العصبية التي أعرب عنها في YFP. تغيير بروتوكول تبادل المعلومات البصرية مثل أن الجهاز يعاني من الجفاف باستخدام الإيثانول سلسلة متدرجة وقد وجد للحد من الأضرار التي لحقت البروتينات الفلورية والحفاظ على إشارة الفلورسنت للتصوير multiphoton. 4 استخدام أسلوب الأمثل من المقاصة البصرية مع الايثانول القائمة على الجفاف و تطهير من BABBبينما محمية من الضوء، وتبين لنا صور عالية الدقة multiphoton من الفلورسنت الأصفر التعبير (YFP) البروتين في الخلايا العصبية لدماغ فأرة أكثر من 2 ملم تحت سطح الأنسجة.

Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP at JoVE.com

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

المجهر Multiphoton من أجهزة الماوس كله هو ممكن عن طريق مسح ضوئيا الجهاز قبل التصوير، ولكن ليس كل البروتوكولات الحفاظ على إشارة الفلورسنت من البروتينات الفلورية. باستخدام أسلوب المقاصة البصرية مع الايثانول القائمة على الجفاف وكحول البنزيل: بنزيل بنزوات المقاصة، وتبين لنا صور عالية الدقة multiphoton من مخ الفأر كله معربا عن YFP.

Multiphoton المجهر من مخ الفأر مسح تعرب عن YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

multiphoton-microscopy-of-cleared-mouse-brain-expressing-yfp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Views.  Yale University. المجهر Multiphoton من أجهزة الماوس كله هو ممكن عن طريق مسح ضوئيا الجهاز قبل التصوير، ولكن ليس كل البروتوكولات الحفاظ على إشارة الفلورسنت من البروتينات الفلورية. باستخدام أسلوب المقاصة البصرية مع الايثانول القائمة على الجفاف وكحول البنزيل: بنزيل بنزوات المقاصة، وتب?...

Video: Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

إعداد أنسجة المخ فأرة للالميكروسكوب Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Intravital المجهري للماوس دوران الأوعية الدقيقة الدماغ باستخدام نافذة مغلقة القحف

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

ركزت شعاع ايون طحن والمجهر الإلكتروني لأنسجة الدماغ

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

عزل LacZ - معربا عن خلايا من أنسجة الأذن الداخلية باستخدام الماوس التدفق الخلوي

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

ميكرون على نطاق بصري القرار المقطعي من أدمغة فئران كاملة مع متحد البؤر المجهري الخفيفة ورقة

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا<em&gt; في فيفو</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

تنقية ماوس سفن الدماغ

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

تسجيل درجة الحرارة التي يسببها العصبية آخر من خلال مراقبة التغيرات الكالسيوم في البصلة الشمية من<em&gt; القيطم المورق</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...