このプロトコルは、神経化学的および行動異常を強調する可能性のあるニューロンおよび樹状脊椎における潜在的な形態学的変化を評価することを可能にする。これは、高度な再建ソフトウェアと組み合わせて、研究者が神経認知機能障害の根底にある可能なメカニズムを解明することを可能にするラットの異なる脳領域のニューロンを視覚化するのにユニークで有用です。まず、原稿の指示に従ってPVP溶液を準備します。
チューブにPVPを充填し、20分間放置します。そして、10ミリリットルの注射器でもう一方の端を通してそれを排出します。170ミリグラムのタングステンマイクロキャリアビーズと250マイクロリットルの塩化メチレンを組み合わせます。
その後、徹底的にサスペンションを渦。次に、6ミリグラムの親油性DilC18(3)色素を300マイクロリットルの塩化メチレンとボルテックスに加えます。ガラススライド上にタングステンビーズ懸濁液のピペット250マイクロリットル。
懸濁液が空気乾燥するのを待ち、300マイクロリットルの染料溶液を加えます。乾燥したら、カミソリを使用して混合物を2つの1.5ミリリットル遠心管に分割し、チューブに水を充填します。均質になるまで水浴で混合物を超音波処理します。
超音波処理器の先端が直接チューブ上にあることを確認します。2つの混合物を15ミリリットルの円錐管に組み合わせます。そして、さらに3分間超音波処理し、染料コーティングされたビーズの大きな塊が残らないようにします。
超音波処理の後、10ミリリットルのシリンジでPVPコーティングチューブに混合物を引き込みます。そして、準備ステーションにチューブを供給します。チューブを 1 分間回転させます。
慎重に注射器を使用してすべての水を除去します。窒素ガスをオンにし、窒素の流れを毎分約0.5リットルに調整します。準備ステーションでチューブを回転させ、窒素で30分間乾燥させます。
駅からチューブを取り外し、チューブカッターで13ミリメートルのセグメントにカットします。ラットが有害な刺激に反応せず、反射神経がないことを確認してください。その後、サピーヌの位置にそれを確保します。
胸部中線に沿って切開を行います。ダイヤフラムを分離し、はさみで胸を開きます。その後、20ゲージ25ミリメートルの針を左心室に挿入します。
すぐに右心房をはさみで切り、1分あたり5ミリメートルの流量で100ミリモルPBSの15ミリリットルを浸透させます。その後、PBSに緩衝された4%PFAの100ミリリットルを浸透させます。灌流後、ラットの脳全体を取り除く。
4%PFAで10分間後置きします。ラットの脳マトリックスを使用して、厚さ500マイクロメートルのコロナセクションを切断します。拳をカットし、所定の位置にブレードを保ちます。
その後、2番目のブレードで2回目のカットを行い、最初のブレードを垂直に取り外し、ブレード表面に組織を維持します。各井戸にPBSの1ミリリットルと24ウェルプレートに脳スライスを置きます.そして、すべてのスライスがカットされるまで、プロセスを繰り返します。
各ターゲットからPBSを削除します。軟骨をディル/タングステンチューブでロードし、アプリケータに入れなさい。2つのメッシュスクリーンの間にフィルターペーパーを置きます。
そして、アプリケーターをヘリウムホースに接続します。その後、ヘリウムの出力圧力を1平方インチ当たり90ポンドに調整します。サンプルとメッシュ画面の間のターゲットウェルの中央にアプリケータを垂直に配置します。
その後、ディル/タングステンチューブを発射します。次のチューブで軟骨をロードし、連続残りのスライスのチューブからビーズを発射します。24ウェルプレートに100ミリモルPBSを充填します。
そして、新鮮なPBSの500マイクロリットルでスライスを3回洗います。洗浄中にスライスがひっくり返らないようにします。終了したら、スライスに新鮮なPBSを500マイクロリットル加えます。
そして、暗闇の中で摂氏4度で3時間インキュベートします。インキュベーションの後、細かいブラシを使用して、脳のスライスをガラススライドに移します。そして、すぐに各セクションにアンチフェード実装媒体の1ミリリットルを追加します。
セクションの上に22 x 15ミリメートルのカバースリップを置き、暗闇の中でスライドを乾燥させます。共焦点顕微鏡システムをオンにし、60倍の目的に切り替えます。原稿の方向に合わせて画像設定を調整します。
そして、脳領域の境界とニューロンの形態学的特徴に基づいて、標的ニューロン型のZスタック画像を取得する。出生後1日目にF344/Nラットから一次皮質ニューロンを分離し、35ミリメートルのガラス底皿で1週間培養する。分離後3日目にメディアの半分をリフレッシュする。
100ミリモルPBSの1ミリリットルで皿を2回洗います。そして、室温で15分間4%PFAで細胞を固定します。前述のようにセルにバリスティックラベルを付けます。
そして、PBSの1ミリリットルでさらに3回洗います。500マイクロリットルのPBSを細胞に加え、暗闇の中で摂氏4度で3時間インキュベートします。その後、アンチフェードマウントメディアの200マイクロリットルを追加します。
各標的ニューロンのZスタック画像を取得します。ラット脳切片の海馬領域における典型的な錐体ニューロンは、1つの大きな天端樹状突起およびいくつかの小さな基底樹状突起を特徴とする弾道標識技術で同定された。神経再建定量解析ソフトウェアを使用して樹状枝を追跡し、脊椎を検出しました。
その後、このソフトウェアは、樹状分岐の複雑さと神経細胞の複雑さを評価するために使用されました。樹状脊椎の形態学的変化を、長さ、体積、および頭部の直径を用いて評価した。その後、棘は薄い、頑固な、そしてキノコの棘に分類された。
各半径間の脊椎の数の相対頻度を調べた。さらに弾道標識技術は、細胞培養における一次錐型の錐体ニューロンで検証された。ピラミッド型ニューロンは、相馬と大きな尖形デンドライトの三角形の形状に基づいて同定された。
その後、神経再建ソフトウェアを用いて、細い樹状脊椎と樹状脊椎の長さの分布を解析した。このプロトコルを試みる際には、大きな塊や弾道染料被覆タングステンビーズのクラスターが準備を開始しないようにすることが重要です。塊は、個々のニューロンを区別することを許可しません。
神経再建ソフトウェアと組み合わせることで、この方法は、海馬錐体ニューロンにおける神経および樹状脊椎形態を調べることができます。ニューロン再構成ソフトウェアは、樹状脊椎の自動補助分類を提供するアルゴリズムを利用します。複数の神経パラメーターの定量化は、ニューロン認知機能障害の根底にあるメカニズムをよりよく理解する機会を提供します。
