이 프로토콜은 신경 화학및 행동 이상을 강조할 수 있는 신경 세포 및 수지상 척추에 있는 잠재적인 형태학적 변경을 평가하는 가능하게 합니다. 그것은 쥐에 있는 다른 두뇌 지구에 있는 신경세포를 시각화하기 위한 독특하고 유용합니다, 정교한 재건 소프트웨어와 함께 연구원이 신경 인지 기능 장애의 근본적인 가능한 기계장치를 해명할 수 있습니다. 원고 의 지시에 따라 PVP 솔루션을 준비하여 시작합니다.
튜브를 PVP로 채우고 20 분 동안 둡니다. 그리고 10 밀리리터 주사기로 다른 쪽 끝을 통해 추방하십시오. 170 밀리그램의 텅스텐 마이크로 캐리어 구슬과 250 마이크로리터의 메틸렌 염화물을 결합합니다.
그런 다음 서스펜션을 철저히 소용돌이시다. 다음으로, 메틸렌 염화물 및 소용돌이의 300 마이크로 리터에 300 마이크로 리터에 지방혈 성 DilC18 (3)염료6 밀리그램을 추가합니다. 텅스텐 비드 서스펜션의 파이프 250 마이크로리터가 유리 슬라이드에 들어있습니다.
서스펜션이 공기가 건조할 때까지 기다렸다가 300마이크로리터의 염료 용액을 추가하십시오. 일단 건조되면 면도기를 사용하여 혼합물을 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브 두 개로 나누고 튜브를 물로 채웁니다. 균일 할 때까지 수조에 혼합물을 초음파 처리합니다.
초음파 처리기 팁이 튜브에 직접 놓여 있는지 확인합니다. 15 밀리리터 원내 튜브에 두 혼합물을 결합합니다. 그리고 또 다른 3 분 동안 초음파 처리, 염료 코팅 구슬의 큰 덩어리가 남아 있지 않도록.
초음파 처리 후, 10 밀리리터 주사기와 PVP 코팅 튜브에 혼합물을 그립니다. 그리고 준비 역에 튜브를 공급합니다. 튜브를 1분 동안 회전합니다.
주사기를 사용하여 모든 물을 조심스럽게 제거하십시오. 질소 가스를 켜고 질소 흐름을 분당 약 0.5리터로 조정합니다. 준비 스테이션에서 튜브를 회전시키고 질소로 30 분 동안 건조시십시오.
역에서 튜브를 제거하고 튜브 커터로 13밀리미터 세그먼트로 잘라냅니다. 쥐가 유해 자극에 반응하지 않고 반사 신경이 없는지 확인하십시오. 그런 다음 스핀 위치에 고정하십시오.
흉부 미드 라인을 따라 절개를합니다. 다이어프램을 분리하고 가위로 가슴을 엽니다. 그런 다음 20 게이지 25 mm 바늘을 왼쪽 심실에 삽입합니다.
즉시 가위로 오른쪽 아트리움을 자르고 100 밀리리터 PBS의 15 밀리리터를 분당 5밀리미터의 유량으로 감내냅니다. 그런 다음 PBS에서 버퍼링된 4%PFA의 100밀리리터를 perfuse. 관류 후, 전체 쥐 뇌를 제거합니다.
그리고 10 분 동안 4 % PFA로 우편으로 바치게합니다. 쥐 뇌 매트릭스를 사용하여 500 마이크로미터 두께의 관상 섹션을 절단합니다. 주먹을 잘라 내고 블레이드를 제자리에 유지합니다.
그런 다음 두 번째 블레이드로 두 번째 절단을 하고 첫 번째 블레이드를 수직으로 제거하여 블레이드 표면에 조직을 유지합니다. 뇌 슬라이스를 24웰 플레이트에 배치하여 각 웰에 PBS 1 밀리리터를 배치합니다. 그리고 모든 조각이 잘될 때까지 프로세스를 반복합니다.
대상각에서 PBS를 잘 제거합니다. 연골을 딜/텅스텐 튜브 조각으로 적재하고 어플리케이터에 넣습니다. 두 메쉬 스크린 사이에 필터 용지 를 넣습니다.
그리고 헬륨 호스에 어플리케이터를 연결합니다. 그런 다음 헬륨의 출력 압력을 평방 인치 당 90 파운드로 조정합니다. 어플리케이터를 시료와 메쉬 화면 사이에 1.5cm 의 대상 우물 중앙에 수직으로 배치합니다.
그런 다음 딜 /텅스텐 튜브를 발사합니다. 다음 튜브로 연골을 적재하고 나머지 조각의 튜브에서 구슬을 지속적으로 발사합니다. 100 밀리머 PBS와 24 웰 플레이트를 채웁니다.
그리고 신선한 PBS의 500 마이크로 리터로 슬라이스를 세 번 세척합니다. 세척 중에 슬라이스가 뒤집지 않도록 합니다. 완료되면 500 마이크로리터의 신선한 PBS를 슬라이스에 추가합니다.
그리고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 3 시간 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후 미세 브러시를 사용하여 뇌 조각을 유리 슬라이드로 옮기십시오. 그리고 즉시 각 섹션에 안티 페이드 장착 매체의 1 밀리리터를 추가합니다.
섹션 위에 22 by 15mm 커버슬립을 놓고 어둠 속에서 슬라이드를 건조시다. 공초점 현미경 시스템을 켜고 60X 목표로 전환합니다. 원고 방향에 따라 이미징 설정을 조정합니다.
및 뇌 영역 경계 및 뉴런의 형태학적 특성에 따라 표적 뉴런 유형에 대한 Z 스택 이미지를 얻을 수 있습니다. 출생 후 날에 F344/N 쥐에서 기본 피질 뉴런을 분리하고 일주일 동안 35 밀리미터 유리 바닥 접시에 그들을 문화. 격리 후 3일째에 중간 크기의 절반을 상쾌하게 합니다.
100 밀리머 PBS의 1 밀리리터로 두 번 접시를 씻으시다. 그리고 실온에서 15 분 동안 4 %의 PFA로 세포를 고정하십시오. 이전에 설명된 바와 같이 세포를 탄도적으로 레이블을 지정합니다.
그리고 PBS의 1 밀리리터로 세 번 더 씻으시다. 500 마이크로리터의 PBS를 세포에 추가하고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 3 시간 동안 배양하십시오. 그런 다음 200 마이크로리터의 페이드 마운팅 매체를 추가합니다.
그리고 각 표적 뉴런에 대한 Z 스택 이미지를 가져옵니다. 쥐 뇌 섹션의 해마 부위의 전형적인 피라미드 뉴런은 소마 주변의 하나의 큰 정점과 여러 개의 작은 기저 선점특징탄도 라벨링 기술로 확인되었다. 뉴런 재건 정량 분석 소프트웨어는 수지상 가지를 추적하고 척추를 감지하는 데 사용되었습니다.
그 후, 소프트웨어는 수지상 분기 복잡성 및 신경 식목 복잡성을 평가하는 데 사용되었다. 수지상 척추의 형태학적 변화는 길이, 부피 및 머리 직경을 사용하여 평가되었다. 그런 다음 척추는 얇고, 그루터기, 버섯 등뼈로 분류되었다.
그리고 각 반경 사이의 척추 수의 상대적 주파수를 검사하였다. 더 많은 탄도 라벨링 기술은 세포 배양에서 1 차적인 피라미드 뉴런에서 검증되었다. 피라미드 뉴런은 소마와 큰 정점의 삼각형 모양에 기초하여 확인되었다.
그런 다음 뉴런 재건 소프트웨어는 얇은 수지상 척추및 수지상 척추 길이의 분포를 분석하는 데 사용되었다. 이 프로토콜을 시도할 때는 탄도 염료 코팅 텅스텐 구슬의 큰 덩어리 또는 클러스터가 준비를 시작하는 것을 피하는 것이 중요합니다. 덩어리는 개별 적인 뉴런을 구별하는 것을 허용하지 않을 것입니다.
신경 재건 소프트웨어와 결합이 방법은 우리가 해마 피라미드 뉴런에서 신경 및 수지상 척추 형태를 검사 할 수 있습니다. 신경 재건 소프트웨어는 알고리즘을 사용하여 수지상 척추의 자동 보조 분류를 제공합니다. 다중 신경 매개 변수의 정량화는 더 나은 신경 인지 기능 장애의 메커니즘을 이해하는 기회를 제공합니다.
