Dieses Protokoll ermöglicht es, mögliche morphologische Veränderungen in Neuronen und dendritischen Stacheln zu bewerten, die neurochemische und Verhaltensauffälligkeiten unterstreichen können. Es ist einzigartig und nützlich für die Visualisierung von Neuronen in verschiedenen Gehirnregionen bei Ratten, die in Kombination mit ausgeklügelter Rekonstruktionssoftware forschern ermöglicht, die möglichen Mechanismen zu klären, die neurokognitiven Dysfunktion zugrunde liegen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der PVP-Lösung nach Manuskriptanweisungen.
Füllen Sie den Schlauch mit PVP und lassen Sie es für 20 Minuten. Und vertreiben Sie es durch das andere Ende mit einer 10-Milliliter-Spritze. Kombinieren Sie 170 Milligramm Wolfram-Mikroträger-Perlen mit 250 Mikroliter Methylenchlorid.
Dann gründlich wirbeln die Suspension. Als nächstes fügen Sie 6 Milligramm lipophilen DilC18(3)Farbstoff zu 300 Mikroliter Methylenchlorid und Wirbel hinzu. Pipetten 250 Mikroliter der Wolfram-Perlen-Suspension auf einem Glasschlitten.
Warten Sie, bis die Suspension lufttrocken ist, und fügen Sie 300 Mikroliter der Farbstofflösung hinzu. Nach dem Trocknen verwenden Sie ein Rasiermesser, um die Mischung in zwei 1,5 Milliliter Zentrifugenrohre aufzuteilen und die Rohre mit Wasser zu füllen. Beschallen Sie die Mischung in einem Wasserbad, bis sie homogen ist.
Sicherstellen, dass die Schallspitze direkt auf den Rohren liegt. Kombinieren Sie die beiden Mischungen in einem 15 Milliliter konischen Rohr. Und für weitere drei Minuten beschallen, um sicherzustellen, dass keine großen Klumpen von Farbstoff beschichteten Perlen bleiben.
Nach der Beschallung die Mischung mit einer 10-Milliliter-Spritze in den PVP-beschichteten Schlauch ziehen. Und füttern Sie die Schläuche in die Aufbereitungsstation. Drehen Sie die Schläuche für eine Minute.
Entfernen Sie das gesamte Wasser vorsichtig mit einer Spritze. Schalten Sie das Stickstoffgas ein und stellen Sie den Stickstoffstrom auf etwa 0,5 Liter pro Minute ein. Drehen Sie die Schläuche in der Aufbereitungsstation und trocknen Sie sie 30 Minuten lang mit Stickstoff.
Entfernen Sie die Schläuche von der Station und schneiden Sie sie mit einem Schlauchschneider in 13-Millimeter-Segmente. Stellen Sie sicher, dass die Ratte nicht auf schädliche Reize reagiert und Reflexe fehlen. Dann sichern Sie es in der Supine-Position.
Machen Sie einen Schnitt entlang der brustbrusten Mittellinie. Trennen Sie das Zwerchfell und öffnen Sie die Brust mit einer Schere. Dann legen Sie eine 20 Gauge 25 Millimeter Nadel in den linken Ventrikel.
Schneiden Sie sofort das rechte Atrium mit der Schere und durchdringen Sie 15 Milliliter 100 Millimolar PBS mit einem Durchfluss von 5 Millimetern pro Minute. Dann durchdringen Sie 100 Milliliter 4%PFA gepuffert in PBS. Nach der Perfusion, entfernen Sie das gesamte Rattenhirn.
Und postfix es mit 4%PFA für 10 Minuten. Verwenden Sie eine Ratten-Gehirnmatrix, um 500 Mikrometer dicken koronalen Abschnitt zu schneiden. Machen Sie einen Faustschnitt und halten Sie die Klinge an Ort und Stelle.
Dann machen Sie einen zweiten Schnitt mit einer zweiten Klinge und vertikal entfernen Sie die erste Klinge, halten Sie das Gewebe auf der Klingenoberfläche. Legen Sie die Gehirnscheiben in die 24-Well-Platte mit 1 Milliliter PBS in jedem Brunnen. Und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Scheiben geschnitten wurden.
Entfernen Sie PBS von jedem Zielbrunnen. Den Knorpel mit einem Stück Dil/Wolfram-Schläuche nieren und in den Applikator legen. Legen Sie ein Stück Filterpapier zwischen die beiden Netzsiebe.
Und schließen Sie den Applikator an den Heliumschlauch an. Passen Sie dann den Ausgangsdruck von Helium auf 90 Pfund pro Quadratzoll an. Platzieren Sie den Applikator vertikal in der Mitte des Zielbrunnens 1,5 Zentimeter zwischen der Probe und dem Netzbildschirm.
Dann feuern Sie die Dil/Wolfram Rohre. Den Knorpel mit dem nächsten Schlauch beladen und die Perlen kontinuierlich aus den Schläuchen auf die restlichen Scheiben abfeuern. Füllen Sie die 24-Well-Platte mit 100 Millimolar PBS.
Und waschen Sie die Scheiben dreimal mit 500 Mikroliter frisches PBS. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben während des Waschens nicht umkippen. Wenn Sie fertig sind, fügen Sie 500 Mikroliter frisches PBS in die Scheiben.
Und bebrüten sie drei Stunden bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Nach der Inkubation, verwenden Sie eine feine Bürste, um die Gehirnscheiben auf Glasrutschen zu übertragen. Und sofort einen Milliliter Antifade-Montagemedium zu jedem Abschnitt hinzufügen.
Legen Sie einen 22 mal 15 Millimeter großen Deckel über die Abschnitte und trocknen Sie die Dias im Dunkeln. Schalten Sie das konfokale Mikroskopsystem ein und wechseln Sie zu einem 60X-Objektiv. Passen Sie die Bildeinstellungen entsprechend den Anweisungen des Manuskripts an.
Und erhalten Z-Stack-Bilder für den gezielten Neuronentyp basierend auf Gehirnregionsgrenzen und morphologischen Eigenschaften von Neuronen. Isolieren Sie primäre kortikale Neuron von F344/N Ratten am ersten Tag der Geburt und kulturen Sie sie in einer 35 Millimeter Glasbodenschale für eine Woche. Erfrischende Hälfte des Mediums am dritten Tag nach der Isolation.
Waschen Sie die Schale zweimal mit 1 Milliliter 100 Millimolar PBS. Und fixieren Sie die Zellen mit 4%PFA für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die Zellen werden wie zuvor beschrieben als ballistisch gekennzeichnet.
Und waschen Sie sie noch dreimal mit 1 Milliliter PBS. Fügen Sie 500 Mikroliter PBS zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie sie für drei Stunden bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Dann fügen Sie 200 Mikroliter Antifade Montagemedium.
Und erhalten Z-Stack-Bilder für jedes Zielneuron. Typische pyramidale Neuronen in der Hippocampusregion in den Hirnabschnitten der Ratte wurden mit ballistischer Etikettierungstechnologie identifiziert, die durch einen großen apikalen Dendrit und mehrere kleinere Basaldendriten um das Soma gekennzeichnet ist. Neuronale Rekonstruktion quantitative Analyse-Software wurde verwendet, um dendritische Zweige zu verfolgen und Stacheln zu erkennen.
Anschließend wurde die Software verwendet, um die dendritische Verzweigungskomplexität und neuronale Arbor-Komplexität zu bewerten. Morphologische Veränderungen der dendritischen Stacheln wurden anhand von Länge, Volumen und Kopfdurchmesser bewertet. Dann wurden Stacheln in dünne, stumpfe und Pilzdornen klassifiziert.
Und die relative Häufigkeit der Anzahl der Stacheln zwischen den einzelnen Radius wurde untersucht. Darüber hinaus wurde die ballistische Etikettierungstechnik auf einem primären pyramidenförmigen Neuron in der Zellkultur validiert. Pyramidenneuronen wurden anhand der Dreiecksform des Soma und des großen apikalen Dendriten identifiziert.
Dann wurde neuronale Rekonstruktionssoftware verwendet, um die Verteilung von dünnen dendritischen Stacheln und dendritischen Wirbelsäulenlänge zu analysieren. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, große Klumpen oder Cluster von ballistischen Farbstoff beschichtet Enwolframperlen Beginnen der Vorbereitung zu vermeiden. Klumpen würden es nicht erlauben, einzelne Neuronen zu unterscheiden.
In Kombination mit neuronaler Rekonstruktionssoftware ermöglicht uns diese Methode, neuronale und dendritische Wirbelsäulenmorphologie in hippocampalen Pyramidenneuronen zu untersuchen. Neuronale Rekonstruktionssoftware verwenden einen Algorithmus, um eine automatische assistierte Klassifizierung der dendritischen Stacheln zu bieten. Die Quantifizierung mehrerer neuronaler Parameter bietet die Möglichkeit, den Mechanismus, der der neuronalen kognitiven Dysfunktion zugrunde liegt, besser zu verstehen.
