Bu protokol, nörokimyasal ve davranışsal anormalliklerin altını çizebilecek nöronve dendritik dikenlerde potansiyel morfolojik değişikliklerin değerlendirilmesini mümkün kılmıştır. Bu benzersiz ve sıçanlarda farklı beyin bölgelerinde nöronların görselleştirilmesi için yararlıdır, hangi sofistike yeniden yapılanma yazılımı ile birlikte araştırmacılar nörobilişsel disfonksiyon altında yatan olası mekanizmaları açıklamak için izin verir. PVP çözümlerini el yazması talimatlara göre hazırlayarak başlayın.
Tüpü PVP ile doldurun ve 20 dakika bekletin. Ve 10 mililitrelik bir şırıngayla diğer taraftan dışarı at. 170 miligram tungsten mikrotaşıyıcı boncukları 250 mikrolitre metilen klorür ile birleştirin.
Sonra iyice süspansiyon girdap. Sonra, metilen klorür ve girdap 300 mikrolitre lipophilic DilC18(3) boya 6 miligram ekleyin. Pipet 250 tungsten boncuk süspansiyon bir cam slayt üzerine mikrolitre.
Süspansiyonun kurumasını bekleyin ve boya çözeltisinin 300 mikrolitresini ekleyin. Kuruduktan sonra, karışımı iki adet 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne bölmek ve tüpleri suyla doldurmak için bir jilet kullanın. Homojen kadar bir su banyosunda karışımı sonicate.
Sonicator ucu tüpler üzerinde doğrudan yatıyor emin olun. 15 mililitrelik konik bir tüp iki karışımları birleştirin. Ve üç dakika daha sonicate, boya kaplı boncuk hiçbir büyük kümeleri kalır emin olun.
Sonication sonra, 10 mililitreşile PVP kaplı boru içine karışımı çizin. Ve tüpü hazırlık istasyonuna yedirin. Tüpü bir dakika döndürün.
Bir şırınga kullanarak tüm suyu dikkatlice çıkarın. Azot gazını açın ve azot akışını dakikada yaklaşık 0,5 litreye ayarlayın. Tüpü hazırlık istasyonunda döndürün ve 30 dakika boyunca azot ile kurulayın.
Boruyu istasyondan çıkarın ve bir boru kesicisi ile 13 milimetrelik parçalarhalinde kesin. Sıçan zararlı uyaranlara yanıt olmadığından emin olun ve refleksleri yok. Sonra supine pozisyonda güvenli.
Torasik orta hat boyunca bir kesi yapın. Diyaframı ayırın ve göğsü makasla açın. Sonra sol ventrikül içine 20 gauge 25 milimetrelik bir iğne takın.
Hemen makas ile sağ atriyum kesilmiş ve dakikada 5 milimetre akış hızı ile 100 milimolar PBS 15 mililitre perfuse. Daha sonra PBS tamponlu% 4 PFA 100 mililitre perfuse. Perfüzyondan sonra, tüm sıçan beynini çıkarın.
Ve 10 dakika boyunca% 4 PFA ile postfix. 500 mikrometre kalınlığında koronal kesit kesmek için bir sıçan beyin matris kullanın. Bir yumruk kes ve yerinde bıçak tutun.
Sonra ikinci bir bıçak ile ikinci bir kesim yapmak ve dikey olarak ilk bıçak kaldırmak, bıçak yüzeyinde doku tutmak. Her kuyuda 1 mililitre PBS ile 24 kuyulu plakaya beyin dilimlerini yerleştirin. Ve tüm dilimler kesilene kadar işlemi tekrarlayın.
PBS'yi hedeflenen her kuyudan çıkarın. Kıkırdağı Dil/tungsten boru parçasıile yükleyin ve aplikatöre yerleştirin. İki kafes ekran arasına bir parça filtre kağıdı koyun.
Aplikatörü helyum hortumuna bağlayın. Sonra helyum çıkış basıncını inç kare başına 90 pound ayarlayın. Aplikatörü hedeflenen kuyunun ortasına dikey olarak yerleştirin örnek le örgü ekran arasına 1,5 santimetre.
Sonra Dil / tungsten tüp ateş. Kıkırdağı bir sonraki tüple yükleyin ve kalan dilimler üzerindeki boncukları sürekli olarak ateşleyin. 24 kuyulu plakayı 100 milimolar PBS ile doldurun.
Dilimleri 500 mikrolitre taze PBS ile üç kez yıkayın. Yıkama sırasında dilimlerin ters çevrilmediğinden emin olun. Bittiğinde, dilimlere 500 mikrolitre taze PBS ekleyin.
Ve onları karanlıkta dört derece santigrat derecede üç saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, beyin dilimlerini cam slaytlara aktarmak için ince bir fırça kullanın. Ve hemen her bölüme bir mililitre antifade montaj ortamı ekleyin.
Bölümlerin üzerine 22'ye 15 milimetrelik bir kapak kaydırın ve slaytları karanlıkta kurulayın. Konfokal mikroskop sistemini açın ve 60X hedefine geçin. Görüntüleme ayarlarını el yazması talimatlara göre ayarlayın.
Ve beyin bölgesi sınırları ve nöronların morfolojik özelliklerine göre hedeflenen nöron tipi için Z-yığın görüntüleri elde. Birinci doğum sonrası ilk doğum gününde F344/N sıçanlarından birincil kortikal nöron izole edin ve onları bir hafta boyunca 35 milimetrelik cam alt çanakta kültürleyin. Tecritten sonraki üçüncü gün ortamın yarısını serinletin.
1 mililitre 100 milimolar PBS ile iki kez çanak yıkayın. Ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 PFA ile hücreleri düzeltmek. Hücreleri daha önce açıklandığı gibi balistik olarak etiketle.
Ve 1 mililitre PBS ile üç kez daha yıkayın. Hücrelere 500 mikrolitre PBS ekleyin ve karanlıkta dört derece santigrat üç saat kuluçka. Daha sonra 200 mikrolitre antifade montaj ortamı ekleyin.
Ve her hedeflenen nöron için Z-yığın görüntüleri elde edin. Sıçan beyin bölümlerinde hipokampal bölgede tipik piramidal nöronlar bir büyük apikal dendrit ve soma etrafında birkaç küçük bazal dendritler ile karakterize balistik etiketleme teknolojisi ile tespit edildi. Nöronal rekonstrüksiyon kantitatif analiz yazılımı dendritik dalları izlemek ve dikenleri tespit etmek için kullanılmıştır.
Daha sonra, yazılım dendritik dallanma karmaşıklığı ve nöronal arbor karmaşıklığı değerlendirmek için kullanılmıştır. Dendritik dikenlerde morfolojik değişiklikler uzunluk, hacim ve baş çapı kullanılarak değerlendirildi. Daha sonra dikenler ince, güdük ve mantar dikenleri olarak sınıflandırıldı.
Ve her yarıçap arasındaki diken sayısının göreceli frekansı incelendi. Ayrıca balistik etiketleme tekniği hücre kültüründe birincil piramidal nöron üzerinde doğrulandı. Piramidal nöronlar soma ve büyük apikal dendit üçgen şekline göre tanımlanmış.
Daha sonra ince dendritik dikenlerin ve dendritik omurga uzunluğunun dağılımını analiz etmek için nöronal rekonstrüksiyon yazılımı kullanıldı. Bu protokolü çalışırken, büyük kümeler veya balistik boya kaplı tungsten boncuk kümeleri hazırlık başlayan önlemek önemlidir. Kümeler tek tek nöronların ayırt edilmesine izin vermez.
Nöronal rekonstrüksiyon yazılımı ile birlikte bu yöntem bize hipokampal piramidal nöronlarda nöronal ve dendritik omurga morfolojisi incelemek için izin verir. Nöronal rekonstrüksiyon yazılımı dendritik dikenlerin otomatik destekli sınıflandırmasını sunmak için bir algoritma kullanır. Birden fazla nöronal parametrelerin nicelleştirilmesi daha iyi nöronal kognitif disfonksiyon altında yatan mekanizmaanlamak için bir fırsat sunuyor.
