يوفر هذا البروتوكول نموذجًا قويًا قابلًا للاستنساخ من تراكم ألفا سينوكلين في الخلايا العصبية الدوبامين الأولية لدراسة الآليات والعلاجات التي قد تنظم هذا التراكم. preformed ألفا-synuclein fibrils الحث التدريجي، تراكم البروتين استنساخ عالية جنبا إلى جنب مع التصوير الآلي وتحليل الصور غير متحيزة، وهذا البروتوكول يسهل سريع نسبيا، متوسطة إلى عالية فحص الإنتاجية من تراكم ألفا سينوكلين تثبيط الشاحنات. قد يكون تراكم ألفا سينوكلين التدريجي أحد العوامل التي تعرض وظيفة الخلايا العصبية للخطر في مرض باركنسون وبعض الهيئات النووية.
قد تصبح الجزيئات الجديدة التي تمنع مثل هذا التراكم علاجات جديدة للانحطاط العصبي. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول هو خطوة هامة لإنشاء أداة قياسية وموثوق بها لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم تراكم ألفا سينوكلين في الخلايا العصبية الدوبامين. ومن خلال هذا الإجراء، ستكون جوليا كونوفالوفا، طالبة دكتوراه من مختبري.
قبل إعداد ثقافة خلية منتصف القرنية الأولية ، أضف 50 ميكرولترات من الدوبامين ، وسط الخلايا العصبية ، إلى كل بئر من بولي - إل أورنيثين المغلفة 96 لوحة جيدا واستخدام 100 ميكرولتر ماصات تلميح لpirate المتوسطة في حين خدش في وقت واحد الجزء السفلي من كل بئر في اتجاه دائري لإزالة الطلاء في محيط كل بئر. وتبقى جزيرة مغلفة ببولي-إل-أورنيثين في وسط كل بئر. إضافة 10 ميكرولترات من المتوسط إلى منتصف كل جزيرة المغلفة لإنشاء الجزر الصغيرة.
لإعداد الثقافات المتوسطة الجنينية الأولية من الماوس الجنينية يوم أجنة 13.5 الماوس. تجمع جميع الأرضيات منتصف البريان حصادها في نفس أنبوب 1.5 ملليلتر وغسل العينات ثلاث مرات مع 500 ميكرولترات من الكالسيوم والمغنيسيوم HBSS مجانا لكل غسل. بعد الغسيل الأخير استبدال HBSS مع 0.5٪ التربسين لاحتضان 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة إضافة 500 microliters من DNase أعدت حديثا في حل FBS إلى الأنسجة هضم جزئيا واستخدام ماصة الزجاج سيليكون مع طرف مصقول النار ل triturate الأنسجة. عندما فقط صغيرة, يمكن ملاحظة جزيئات مرئية بالكاد تسمح هذه الأجزاء الأنسجة ليستقر إلى الجزء السفلي من أنبوب جهاز الطرد المركزي الجزئي ونقل هذا متراكب في أنبوب خاوي خاوي مخروطية 15 ملليلتر. إضافة ملليلتر واحد من HBSS إلى أنبوب يحتوي على DNase الأول في FBS ومزيج عدة مرات عن طريق الأنابيب.
نقل ملليلتر واحد من هذا الحل إلى جزيئات الأنسجة المتبقية triturate العينات مرة أخرى. ثم سحب تعليق الخلية المهضمة مع أنبوب من مكبر دون نقل أي شظايا الأنسجة المتبقية بعد triturating عينة الأنسجة مرة أخرى مع DNase المتبقية I وFBS في رواسب HBSS الخلايا التي تم جمعها عن طريق الطرد المركزي وpirpirate اللقلق مغرور دون إزعاج بيليه. غسل الخلايا مرتين في مليلتر اثنين من الدوبامين الدافئة الخلايا العصبية المتوسطة في غسل.
وإعادة تعليق الخلايا في ثلاث مرات 10 إلى خلايا القوة في ستة ميكرولترات من الحرارة الطازجة، وتركيز متوسط في أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. المقبل إزالة المتوسطة من كل جزيرة صغيرة أعدت سابقا وخلط الخلايا مع pipetting لطيف قبل استخدام ماصة 10 ميكرولتر لإضافة ستة ميكروليتر من الخلايا إلى كل جزيرة صغيرة. عندما تم إضافة جميع الخلايا، وملء الآبار الفارغة على حواف لوحة مع 150 ميكرولترات من الماء أو برنامج تلفزيوني ووضع لوحة في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعة واحدة.
في نهاية الحضانة إضافة 100 microliters من الخلايا العصبية الدوبامين الطازجة المتوسطة لكل بئر والعودة لوحة إلى الحاضنة. في اليوم الثامن من ثقافة الخلية في غطاء تدفق لارينار إضافة في 3.75 ميكرولتر من 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الفيبريلات ما قبلية إلى كل بئر تجريبية، و 3.75 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لكل تحكم جيدا. عند العمل مع PFS توخي الحذر حول التلوث غير المرغوب فيه البروتين وبعد ذلك تنظيف غطاء محرك السيارة وجميع الصكوك المرتبطة PF مع 1٪ SDS و 70٪ الإيثانول.
عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة بعد تلطيخ علامات الاهتمام، قم بتحميل لوحة ثقافة 96 على ماسحة لوحة ذات محتوى عالي مزودة بهدف 10 X. ضبط الإعدادات وفقا لمواصفات لوحة 96 جيدا مثل نوع اللعب والشركة المصنعة والحجم والمسافة بين الآبار، ونوع وحجم المتوسطة. حدد منطقة التصوير في الآبار لتغطية جميع الخلايا في كل جزيرة صغيرة واستخدم بئرًا لضبط التركيز التلقائي على تعبير DAPI.
معايرة وقت الاستحواذ لكل قناة فلورية على أساس شدة تلطيخ في آبار التحكم وضبط المعلمات بحيث أن خلايا الدوبامين في الفيبريل المعالجة prebril السيطرة الآبار التي تأوي فسفوسفوسرين 129 ألفا synuclein مجاميع داخل الخلية سوما بوضوح أن تكون مميزة مما يسمح لا لبس فيه الكم من phosphoserine 129 ألفا سينيلوكين الخلايا الإيجابية والسلبية. ثم صورة كل من الآبار المختارة في وقت واحد في جميع القنوات باستخدام بالضبط نفس المعلمات لكل بئر. لتحليل الصور، افتح محلل CellProfiler وحدد V2_THpos.
ملف الخصائص. لفرز الخلايا المجزأة إلى phosphoserine 129 ألفا سينوكلين إيجابية وسلبية الخلايا أولا تعيين عدد الخلايا الجلب إلى 50 خلايا عشوائية وانقر فوق جلب لتحميل الصور من الخلايا المجزأة. اسحب على الأقل 30 خلية إلى سلة المقابلة في الجزء السفلي من الإطار.
حدد استخدام تعزيز لطيف سريع مع 50 قواعد كحد أقصى أو مصنفات الغابات عشوائية وانقر فوق القطار. تعيين الجلب إلى 50 الخلايا الإيجابية وانقر جلب للحصول على مثال إيجابي phosphoserine 129 ألفا سينوكلين الخلايا التي سجلت وفقا لمصنف القطار أو تعيين جلب إلى 50 الخلايا السلبية وانقر فوق جلب للحصول على مثال سالب فوسفوسفيرين 129 ألفا سينوكلين الخلايا وفقا لمصنف القطار. عندما تكون النتائج مرضية, انقر فوق نقاط جميع لتوليد جدول النتائج يلخص عدد من phosphoserine 129 ألفا سينوكلين الخلايا العصبية الدوبامين إيجابية وسلبية في كل بئر.
بعد أيام قليلة من طلاء ثقافة انتشار متجانس يمكن ملاحظتها عن طريق المجهر الخفيف داخل الجزيرة الصغيرة التي تم إنشاؤها قبل الطلاء. الخلايا العصبية الأولية يستقر على أسفل لوحة المغلفة بشكل متجانس ووضع الإسقاطات العصبية. في هذه الصورة، يمكن ملاحظة كتلة صغيرة من الخلايا أقل من 150 متر ميكرو في القطر.
التلطخ المناعي للسيطرة على الماوس الأولية غير المعالجة في منتصف الدماغ الثقافات مع علامات الخلايا العصبية بعد 15 يوما من الطلاء يكشف عن وجود مرفق مقيد من الخلايا داخل الجزر الصغيرة في منتصف آبار الصفيح. الخلايا العصبية الدوبامين المناعية المسمى مع علامة هيدروكسيلاس التيروزين تنتشر في جميع أنحاء الجزيرة الصغيرة في أحادية فصل عن بعضها البعض دون أي تكتل. في ألفا-synuclein الثقافات المعالجة preformed فيبريل، pS129 ألفا synuclein يمكن أيضا أن يلاحظ إدراجات إيجابية.
العلاج مع في المختبر فيفيريلس preformed لمدة سبعة أيام لا يسبب انخفاضا كبيرا في التيروزين هيدروكسيلاس أرقام الخلايا العصبية الإيجابية مقارنة مع المجموعات التجريبية الأخرى. العلاج مع خط الخلية الدبقية المشتقة عامل العصبية ومع ذلك, يقلل من النسبة المئوية من PS129 ألفا-سينوكلين إدراج إيجابي, إيواء الخلايا العصبية الدوبامين الإيجابية التيروزين هيدروكسيلاس. قبل إنشاء الجزر الصغيرة، تأكد من أن الآبار المغلفة بولي-L أونيثين يتم غسلها بقوة.
أيضا تأكد من استخدام وسائل الإعلام الجديدة عند طلاء ثقافات الدماغ الجديدة. ويمكن الجمع بين هذه الطريقة والمثبطات الدوائية لتحرير الجينات لدراسة آثار جينات معينة وموجات فكرية على تجميع النوكلونات. نحن نستخدم هذه الطريقة بشكل روتيني لفحص الجزيئات الجديدة التي تمنع تراكم ألفا سينوكلين.
وقد أظهرت تراكم الآثار المحمية من TDN وتحليل حاليا العديد من الجزيئات مرشح صغيرة.
