이 프로토콜은 살아있는 및 노화 C.elegans에 관심있는 단백질의 분해를 추적하고 정량화 할 수 있습니다. 이 생체 내 및 비침습적 기술은 Dendra2를 밝고 안정적인 불소로 안정적으로 변환하기 위해 설정된 작은 현미경 검사법만 필요합니다. 이 방법은 포유류 시스템뿐만 아니라 제브라피시에 적응할 수 있습니다.
공부하려면 프로테오스타티스 네트워크 내에서의 회전율과 운송 및 인신 매매를 하십시오. 청색광 레이저로 스캔하는 동안 Dendra2의 원치 않는 변환을 유발하지 않도록주의하고 각 시스템 및 융합 단백질에 대한 획득 설정 및 변환 설정을 테스트하고 최적화하십시오. 실험에 대한 원하는 나이에 섭씨 20도에서 나이 일치 선충을 성장하여 시작합니다.
이미징 실험 당일, 이중 증류수에서 3%의 농도로 일반 등급아가로즈를 녹입니다. 아가로즈가 냉각되는 동안, 녹은 아가로즈의 약 400 마이크로 리터의 포부를 용이하게하기 위해 1 밀리리터 파이펫 팁의 끝을 잘라. 조심스럽게 깨끗한 유리 슬라이드에 아가로즈 몇 방울을 추가하고 즉시 두 유리 조각 사이에 아가로즈의 얇은 패드를 만들기 위해 방울 의 상단에 또 다른 슬라이드를 배치합니다.
아가로즈가 건조되면 상단 슬라이드를 조심스럽게 제거하십시오. 충분한 슬라이드가 준비되면 공초점 현미경 소프트웨어를 열고 흥분 및 방출을위한 광 경로를 설정합니다. 녹색 Dendra2의 경우 486 ~ 553 나노미터를 추가하고 빨간색 Dendra2의 경우 580 ~ 740 나노미터를 추가합니다.
플루오로포어의 강도에 따라 두 채널의 힘과 게인을 조정하고 핀홀을 완전히 열도록 설정합니다. 순차채널 모드를 선택하고 트랙을 설정하여 모든 프레임을 전환합니다. 스캔 모드를 프레임으로 설정하고 프레임 크기를 1024로 1024로 설정하여 1개의 라인 스텝을 설정합니다.
평균을 2로 설정하고 단방향 선의 평균 방법과 모드로 평균을 설정합니다. 비트 깊이를 8비트로 설정합니다. Dendra2 변환을 위한 다차원 획득 설정을 정의합니다.
변환 및 표백을 위해 405 나노미터 다이오드 레이저를 60%의 에너지 전력으로 설정하십시오. 사이클과 일반 시작 및 중지 사이에 0.0 밀리초 간격으로 두 사이클의 시간 시리즈를 선택합니다. 표백을 두 개 중 하나를 스캔한 후 시작하여 30회 반복을 반복하고 강도가 50%로 떨어질 때 중지하려면 스냅 이미지를 캡처하기 위해 빠르게 전환하고 중간으로 떨어지는 획득 픽셀의 속도를 정의합니다.
선충을 슬라이드에 장착하려면 영구 마커를 사용하여 각 슬라이드의 아가로즈 패드 반대쪽에 4개의 사각형이 있는 창을 그립니다. 아가로즈 패드 의 중간에 레바미솔 15 마이크로 리터를 추가하고 스테레오 현미경과 와이어 선택을 사용하여 노화와 일치하는 선충을 물방울로 옮길 수 있습니다. 속눈썹 선택을 사용하여 각 선충을 사각형의 한 창으로 부드럽게 이동합니다.
모든 선충이 재배치되었을 때, 웜이 이동을 멈출 때까지 기다렸다가 액체 위에 덮개 미끄러짐을 놓아 이미징 중에 선충을 고정하십시오. 그런 다음 슬라이드를 공초점 현미경 단계에 놓습니다. 녹색 Dendra2 변환의 경우 녹색 형광하에서 20 X 목표의 안장을 사용하여 첫 번째 선충을 찾고 머리 또는 꼬리에 집중하십시오.
공초점 모드로 전환하고 게인 및 레이저 전력을 증가 또는 감소하여 포화 된 이미지를 얻지만 과노출되지 는 않습니다. 선택한 뉴런 주위에 관심 영역을 그리고 관심의 첫 번째 영역을 포함하는 꼬리 주위에 관심의 두 번째 큰 영역을 그립니다. 획득, 표백 및 분석할 첫 번째 영역을 설정합니다.
획득 및 분석할 관심의 두 번째 영역을 설정하지만 표백하지 는 않습니다. 스캔 속도를 최대로 설정하고 스캔을 시작하여 선택한 Dendra2 뉴런을 변환합니다. 변환 직후, 녹색 561 나노미터 레이저로 라이브 스캐닝을 시작하여 빨간색 채널에서 Dendra2를 시각화하고 변환된 뉴런의 초점과 각각의 최대 투영을 찾습니다.
스캔 속도를 낮은 픽셀 거주 속도로 빠르게 설정하고 더 높은 해상도로 두 채널의 스냅샷 이미지를 획득합니다. 이 이미지는 변환 후 0시에 고려됩니다. 그런 다음 식별 가능한 이름과 숫자로 스캔을 저장한 다음 시간 제로 레이블을 저장합니다.
시간이 지남에 따라 Dendra2 저하를 추적하려면 각 선충 뉴런의 시간 제로 이미지를 엽니 다. 동일한 이미지 설정을 사용하여 빨간색 채널에서 라이브 스캔을 시작하고 변환된 빨간색 뉴런을 초점으로 가져옵니다. 그런 다음 획득 매개 변수를 변경하지 않고 첫 번째 이미지와 동일한 속도로 스냅샷을 가져옵니다.
Dendra2를 효율적이고 충분히 변환하고 서로 다른 시간 지점에서 동일한 획득 매개 변수를 유지하기 위해 전환 설정을 신중하게 정의해야 합니다. 변환된 Dendra2 이미지를 분석하려면 피지에서 시간 0 및 두 번째 시간 점 이미지를 열고 분석 및 측정 을 엽니다. 영역 및 통합 밀도 함수를 선택하고 빨간색 채널로 얻은 이미지를 선택합니다.
다각형 선택 도구를 사용하여 0 변환된 뉴런을 중심으로 관심 영역을 그립니다. 뉴런의 윤곽을 제대로 식별하려면 이미지, 조정 및 임계값을 선택하여 강도 임계값을 강조 표시합니다. 선택이 정의되면 분석 및 측정을 클릭합니다.
선택한 관심 영역에 대한 영역, 통합 밀도 및 원시 통합 밀도 값을 포함하여 팝업 결과 창이 나타납니다. 두 번째 시점부터 이미지에 대해 동일한 선택 및 측정 프로세스를 수행합니다. 그런 다음 값을 스프레드시트에 복사합니다.
변환 하기 전에이 대표 분석에서 샘플빨간색 채널에서 흥분 했을 때 빨간색 신호가 보이지 않았다. 조사 결과 HTT-D2가 변환되고 빨간색 신호가 이후에 나타나면서 녹색 신호가 감소했습니다. HTT-D2 발현은 시간이 지남에 따라 저하되어 적색 HTT-D2 신호 의 수준이 감소하고 더 많은 융합 단백질이 새로 합성됨에 따라 녹색 HTT-D2 신호의 증가가능성을 높였습니다.
특히, 꼬리 영역의 뉴런은 머리의 뉴런과 비교하여 훨씬 더 활성화된 것으로 판단되었다. 또한, 전환 후 24시간 후, 머리와 꼬리 뉴런 모두에서 2시간 후에 제어 HTTQ25-D2의 훨씬 더 저하가 있었습니다. 그러나 병원성 HTTQ97-D2에서는 이러한 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 프로테오스타증 네트워크가 신경계 전체에 걸쳐 더 긴 글루타민을 함유한 HTT-D2를 제거할 수 없음을 시사한다.
HTTQ97-D2는 아주 오래된 선충에서 HTTQ25-D2만큼 효율적으로 분해되지 않았으며, 프로테오스타증 네트워크가 오래된 동물에서 응집되고 독성이 있는 종을 제거할 수 없음을 강조했습니다. 중요 한 것은, 꼬리 뉴런은 젊은 선충에서 독성 HTTQ97-D2에 대처할 수 있었다, 다양한 수반 성 프로테오스타증 네트워크 메커니즘HTT-D2를 제거하기 위해 작동 할 수 있음을 시사. 각 샘플에 대해 변환 직후 과다 노출 및 비포화 이미지를 획득하고 시간 내내 해당 샘플에 대해 동일한 설정을 다시 사용합니다.
이 프로토콜을 사용하면 프로테오스타티스 네트워크의 변화를 테스트할 수 있으며, 또한 초해상도 현미경 검사의 도움으로 관련 단백질의 확산을 추적할 수 있습니다.
