Ce protocole permet le suivi et la quantification de la dégradation d’une protéine d’intérêt pour les C.elegans vivants et vieillissants. Cette technique in vivo et non invasive ne nécessite que peu de microscopie mise en place pour convertir de manière fiable Dendra2 en fluorophore lumineux et stable. La méthode est adaptable aux systèmes mammifères, ainsi qu’au poisson zèbre.
Pour étudier, mettre en chiffre d’affaires dans le réseau protéostasie ainsi que le transport et le trafic. Prenez soin de ne pas provoquer la conversion indésirable de Dendra2 lors de la numérisation avec le laser à lumière bleue, et de tester et d’optimiser les paramètres d’acquisition et de conversion pour chaque système et la protéine de fusion. Commencez par cultiver des nématodes appariés selon l’âge à 20 degrés Celsius jusqu’à l’âge désiré pour l’expérience.
Le jour de l’expérience d’imagerie, faire fondre l’agarose de qualité générale à une concentration de 3 % dans l’eau distillée double. Pendant que l’agarose refroidit, coupez la pointe d’une pointe de pipette d’un millilitre pour faciliter l’aspiration d’environ 400 microlitres de l’agarose fondue. Ajouter délicatement quelques gouttes d’agarose sur une lame de verre propre et placer immédiatement une autre glissière sur le dessus des gouttes pour créer une mince garniture d’agarose entre les deux morceaux de verre.
Lorsque l’agarose a séché, retirer délicatement la lame supérieure. Lorsque suffisamment de diapositives ont été préparées, ouvrez le logiciel de microscope confocal et définissez la voie de lumière pour l’excitation et l’émission. Pour le vert Dendra2 ajouter 486 à 553 nanomètres, et pour rouge Dendra2 ajouter 580 à 740 nanomètres.
Ajustez la puissance et le gain des deux canaux en fonction de l’intensité du fluorophore et réglez le sténopé pour l’ouvrir complètement. Sélectionnez un mode canal séquentiel et réglez la piste pour changer chaque image. Définissez le mode d’analyse comme cadre et la taille du cadre comme 1024 d’ici 1024 avec une étape de ligne d’un.
Réglez la moyenne à deux et à la moyenne par la méthode moyenne et le mode de ligne unidirectionnelle. Réglez la profondeur du bit en huit bits. Définissez le paramètre d’acquisition multidimensionnel pour la conversion de Dendra2.
Pour la conversion et le blanchiment, utilisez le laser à diodes de 405 nanomètres réglé à 60% d’énergie. Sélectionnez une série de temps de deux cycles avec un intervalle de 0,0 milliseconde entre les cycles et un début et un arrêt normaux. Réglez le blanchiment pour commencer après l’analyse de l’un des deux, de répéter pendant 30 itérations et de s’arrêter lorsque l’intensité tombe à 50%Puis, définir la vitesse du pixel d’acquisition habiter à jeûner pour la conversion et à moyen pour capturer une image snap.
Pour monter les nématodes sur les diapositives, utilisez un marqueur permanent pour dessiner et numéroter une fenêtre avec quatre carrés à l’opposé de la garniture agarose sur chaque diapositive. Ajouter 15 microlitres de levamisole au milieu de la garniture d’agarose et utiliser un microscope stéréo et un pic de fil à transférer pour les nématodes appariés par âge dans la gouttelette. Utilisez un pic de cils pour déplacer doucement chaque nématode dans une fenêtre du carré.
Lorsque tous les nématodes ont été repositionnés, attendez que les vers aient cessé de bouger avant de placer un bordereau de couverture sur le liquide pour immobiliser les nématodes pendant l’imagerie. Ensuite, placez la lame sur l’étape du microscope confocal. Pour la conversion Dendra2 verte, utilisez l’oculaire de l’objectif 20 X sous fluorescence verte pour localiser le premier nématode et se concentrer sur la tête ou la queue.
Passez au mode confocal et augmentez ou diminuez le gain et la puissance laser pour obtenir une image saturée, mais pas surexposée. Dessinez une région d’intérêt autour du neurone sélectionné et dessinez une deuxième plus grande région d’intérêt autour de la queue qui inclut la première région d’intérêt. Définissez la première région à être acquise, blanchie et analysée.
Définissez la deuxième région d’intérêt à acquérir et à analyser, mais pas blanchie. Réglez la vitesse de numérisation au maximum et commencez l’analyse pour convertir les neurones Dendra2 sélectionnés. Immédiatement après la conversion, commencez la numérisation en direct avec le laser vert de 561 nanomètres pour visualiser Dendra2 dans le canal rouge et trouver la mise au point et la projection maximale respective du neurone converti.
Réglez rapidement le taux d’analyse à une vitesse de vie de pixel inférieure et obtenez une image instantanée des deux canaux à une résolution plus élevée. Cette image est considérée à temps zéro après conversion. Ensuite, enregistrez l’analyse avec un nom et un numéro identifiables, suivi de l’étiquette de temps zéro.
Pour suivre la dégradation de Dendra2 au fil du temps, ouvrez les temps zéro image du neurone nématode respectif. En utilisant le même paramètre d’image, commencez à numériser en direct dans le canal rouge et mettre le neurone rouge converti au point. Ensuite, sans modifier les paramètres d’acquisition, obtenez un instantané à la même vitesse que la première image.
Assurez-vous de définir soigneusement votre paramètre de conversion pour convertir Dendra2 efficacement et suffisamment et pour maintenir les mêmes paramètres d’acquisition à travers différents points de temps. Pour analyser les images Dendra2 converties, ouvrez les images de point de temps zéro et de deuxième temps aux Fidji et ouvrez analyser et définir des mesures. Sélectionnez les fonctions zone et densité intégrée et sélectionnez l’image obtenue avec le canal rouge.
À l’aide de l’outil de sélection polygone, dessiner une région d’intérêt autour du moment zéro neurone converti. Pour identifier correctement les contours du neurone, sélectionnez Image, Ajuster et Seuil pour mettre en évidence les seuils d’intensité. Une fois la sélection définie, cliquez sur Analyser et mesurer.
Une fenêtre de résultats pop up apparaîtra, y compris la zone, la densité intégrée et les valeurs de densité intégrée brute pour la région d’intérêt sélectionnée. Effectuez le même processus de sélection et de mesure de l’image à partir du deuxième point de temps. Ensuite, copiez les valeurs dans la feuille de calcul.
Dans cette analyse représentative avant la conversion, aucun signal rouge n’était visible lorsque l’échantillon était excité dans le canal rouge. Lors de l’irradiation, le signal vert a diminué à mesure que le HTT-D2 était converti et un signal rouge est apparu par la suite. L’expression HTT-D2 s’est dégradée au fil du temps, ce qui a entraîné une réduction des niveaux de signal HTT-D2 rouge et une augmentation possible du signal vert HTT-D2 à mesure que plus de protéines de fusion étaient nouvellement synthétisées.
Notamment, les neurones de la région de la queue ont été déterminés pour être significativement plus actifs par rapport à ceux de la tête. En outre, il y avait significativement plus de dégradation du contrôle HTTQ25-D2 24 heures après la conversion, puis après deux heures dans la tête et les neurones de la queue. Cette différence n’a pas été observée dans HTTQ97-D2 pathogène, cependant, suggérant que le réseau de protéostasie n’ait pas pu enlever HTT-D2 contenant de plus longs étirements de glutamine dans tout le système nerveux.
HTTQ97-D2 n’a pas été dégradé aussi efficacement que HTTQ25-D2 chez de très vieux nématodes, ce qui souligne l’incapacité du réseau de protéostasie à éliminer les espèces agrégées et peut-être toxiques de Huntingtine chez les animaux plus âgés. Fait important, les neurones de la queue ont été en mesure de faire face aux toxiques HTTQ97-D2 chez les jeunes nématodes, ce qui suggère que divers mécanismes concomitants du réseau protéostasie pourraient être à l’œuvre pour éliminer HTT-D2. Pour chaque échantillon acquérir et non surexposé et non saturé image immédiatement après la conversion et réutiliser le même paramètre pour cet échantillon au fil du temps.
Avec ce protocole, il est possible de tester les changements dans un réseau de protéostases, et aussi, à l’aide d’une microscopie à super résolution, de suivre la propagation des protéines associées à la maladie.
