Este protocolo permite o rastreamento e quantificação da degradação de uma proteína de interesse em C.elegans vivos e envelhecidos. Esta técnica in vivo e não invasiva requer apenas pouca microscopia configurada para converter dendra2 de forma confiável em um fluoróforo brilhante e estável. O método é adaptável aos sistemas de mamíferos, bem como aos zebrafish.
Para estudar, colocar em rotatividade dentro da rede de proteostatis, bem como transporte e tráfico. Tome cuidado para não provocar a conversão indesejada de Dendra2 durante a varredura com o laser de luz azul, e para testar e otimizar as configurações de aquisição e configurações de conversão para cada sistema e proteína de fusão. Comece por nematoides com idade crescente a 20 graus Celsius à idade desejada para o experimento.
No dia do experimento de imagem, o grau geral de derretimento surgiu em uma concentração de 3% em água dupla destilada. Enquanto a agarose está esfriando, corte a ponta de uma ponta de pipeta de um mililitro para facilitar a aspiração de aproximadamente 400 microliters da agarose derretida. Adicione cuidadosamente algumas gotas de agarose em um escorregador de vidro limpo e coloque imediatamente outro slide em cima das gotas para criar uma fina almofada de agarose entre as duas peças de vidro.
Quando a agarose secar, remova cuidadosamente o slide superior. Quando formos preparados slides suficientes, abra o software de microscópio confocal e defina o caminho leve para excitação e emissão. Para dendra2 verde adicione 486 a 553 nanômetros, e para dendra2 vermelho adicione 580 a 740 nanômetros.
Ajuste a potência e o ganho de ambos os canais de acordo com a intensidade do fluoróforo e ajuste o orifício para abrir completamente. Selecione um modo de canal sequencial e defina a faixa para alternar cada quadro. Defina o modo de varredura como quadro e o tamanho do quadro como 1024 até 1024 com um passo de linha de um.
Defina a média para dois e a média pelo método médio e modo de linha unidirecional. Ajuste a profundidade do bit em oito bits. Defina a configuração de aquisição multidimensional para a conversão de Dendra2.
Para conversão e branqueamento, use o conjunto de laser de diodo de 405 nanômetros para 60% de energia. Selecione uma série temporal de dois ciclos com um intervalo de 0,0 milissegundo entre os ciclos e um início e parada normais. Defina o branqueamento para iniciar após a varredura de uma das duas, para repetir para 30 iterações e parar quando a intensidade cair para 50%Em seguida, defina a velocidade do pixel de aquisição para rápida conversão e para médio para capturar uma imagem snap.
Para montar os nematoides nos slides, use um marcador permanente para desenhar e numerar uma janela com quatro quadrados no oposto da almofada de agarose em cada slide. Adicione 15 microlitros de levamisole ao meio da almofada agarose e use um microscópio estéreo e uma picareta de arame para transferir para nematoides com correspondência etária na goteta. Use uma picareta de cílios para mover suavemente cada nematoide em uma janela do quadrado.
Quando todos os nematoides tiverem sido reposicionados, espere até que os vermes parem de se mover antes de colocar um deslizamento de cobertura sobre o líquido para imobilizar os nematoides durante a imagem. Em seguida, coloque o slide no estágio do microscópio confocal. Para conversão verde de Dendra2, use a ocular do objetivo 20 X sob fluorescência verde para localizar o primeiro nematodo e focar na cabeça ou cauda.
Mude para o modo confocal e aumente ou diminua o ganho e a potência do laser para obter uma imagem saturada, mas não superexposta. Desenhe uma região de interesse em torno do neurônio selecionado e desenhe uma segunda região maior de interesse em torno da cauda que inclui a primeira região de interesse. Defina a primeira região a ser adquirida, branqueada e analisada.
Definir a segunda região de interesse a ser adquirida e analisada, mas não branqueada. Defina a velocidade da varredura ao máximo e inicie a varredura para converter os neurônios Dendra2 selecionados. Imediatamente após a conversão, comece a digitalizar ao vivo com o laser verde de 561 nanômetros para visualizar Dendra2 no canal vermelho e encontrar o foco e a respectiva projeção máxima do neurônio convertido.
Defina rapidamente a taxa de varredura para uma velocidade de moradia de pixels mais baixa e adquira uma imagem instantânea de ambos os canais em uma resolução mais alta. Esta imagem é considerada no tempo zero após a conversão. Em seguida, salve a varredura com um nome e ou número identificáveis, seguido pelo rótulo time zero.
Para acompanhar a degradação de Dendra2 ao longo do tempo, abra a imagem vezes zero do respectivo neurônio nematode. Usando a mesma configuração de imagem, comece a digitalizar ao vivo no canal vermelho e leve o neurônio vermelho convertido em foco. Em seguida, sem alterar nenhum parâmetro de aquisição, obtenha um instantâneo na mesma velocidade da primeira imagem.
Certifique-se de definir cuidadosamente sua configuração de conversão para converter o Dendra2 de forma eficiente e suficiente e manter os mesmos parâmetros de aquisição em diferentes pontos de tempo. Para analisar as imagens de Dendra2 convertidas, abra as imagens de ponto zero e segundo tempo em Fiji e abra Análise e Definir Medidas. Selecione as funções De Área e Densidade Integrada e selecione a imagem obtida com o canal vermelho.
Usando a Ferramenta de Seleção de Polígono, desenhe uma região de interesse na hora em que zero neurônio convertido. Para identificar corretamente os contornos do neurônio, selecione Imagem, Ajuste e Limiar para destacar os limiares de intensidade. Uma vez definida a seleção, clique em Analisar e Medir.
Uma janela de resultados pop-up aparecerá, incluindo a área, densidade integrada e valores de densidade integrada bruta para a região de interesse selecionada. Realize o mesmo processo de seleção e medição para a imagem a partir do segundo ponto de tempo. Em seguida, copie os valores na planilha.
Nesta análise representativa antes da conversão, nenhum sinal vermelho foi visível quando a amostra foi animada no canal vermelho. Após a irradiação, o sinal verde diminuiu à medida que o HTT-D2 foi convertido e um sinal vermelho apareceu posteriormente. A expressão HTT-D2 degradou-se ao longo do tempo, resultando em uma redução nos níveis de sinal HTT-D2 vermelho e um possível aumento do sinal HTT-D2 verde à medida que mais proteína de fusão foi recentemente sintetizada.
Notavelmente, os neurônios da região da cauda foram determinados a serem significativamente mais ativos em comparação com os da cabeça. Além disso, houve significativamente mais degradação do controle HTTQ25-D2 24 horas após a conversão, em seguida, depois de duas horas em ambos os neurônios da cabeça e da cauda. Essa diferença não foi observada no HTTQ97-D2 patogênico, no entanto, sugerindo que a rede de proteostase foi incapaz de remover htt-D2 contendo trechos mais longos de glutamina em todo o sistema nervoso.
HTTQ97-D2 não foi degradado tão eficientemente quanto o HTTQ25-D2 em nematoides muito antigos, destacando a incapacidade da rede de proteostase de remover espécies agregadas e possivelmente tóxicas de Huntingtin em animais mais velhos. É importante ressaltar que os neurônios da cauda foram capazes de lidar com httq97-D2 tóxico em nematoides jovens, sugerindo que vários mecanismos de rede de proteostase concomitante podem estar trabalhando para remover o HTT-D2. Para cada amostra, adquira e não expuse a imagem e não saturada imediatamente após a conversão e reaproveuse a mesma configuração para essa amostra ao longo do tempo.
Com este protocolo, é possível testar mudanças em uma rede de proteostatis, e também, com a ajuda de microscopia de super-resolução, para acompanhar a disseminação de proteínas associadas à doença.
