Este protocolo permite el seguimiento y cuantificación de la degradación de una proteína de interés en C.elegans vivos y envejecidos. Esta técnica in vivo y no invasiva requiere sólo poca configuración de microscopía para convertir de forma fiable Dendra2 en un fluoróforo brillante y estable. El método es adaptable a los sistemas de mamíferos, así como al pez cebra.
Estudiar, poner en volumen de negocios dentro de la red de proteostatis, así como el transporte y el tráfico. Tenga cuidado de no provocar la conversión no deseada de Dendra2 mientras escanea con el láser de luz azul, y para probar y optimizar la configuración de adquisición y la configuración de conversión para cada sistema y proteína de fusión. Comience por cultivar nematodos coincidentes con la edad a 20 grados centígrados a la edad deseada para el experimento.
El día del experimento de diagnóstico por imágenes, derrite la agarosa de grado general a una concentración del 3% en agua destilada doble. Mientras la agarosa se está enfriando, corte la punta de una punta de pipeta de un mililitro para facilitar la aspiración de aproximadamente 400 microlitros de la agarosa derretida. Agregue cuidadosamente unas gotas de agarosa en un portaobjetos de vidrio limpio e inmediatamente coloque otra diapositiva en la parte superior de las gotas para crear una fina almohadilla de agarosa entre las dos piezas de vidrio.
Cuando la agarosa se haya secado, retire cuidadosamente la corredera superior. Cuando se hayan preparado suficientes diapositivas, abra el software del microscopio confocal y establezca la ruta de la luz para la excitación y la emisión. Para Dendra2 verde añadir 486 a 553 nanómetros, y para rojo Dendra2 añadir 580 a 740 nanómetros.
Ajuste la potencia y la ganancia de ambos canales de acuerdo con la intensidad del fluoróforo y ajuste el agujero para que se abra por completo. Seleccione un modo de canal secuencial y configure la pista para cambiar cada fotograma. Establezca el modo de escaneo como fotograma y el tamaño del fotograma como 1024 por 1024 con un paso de línea de uno.
Establezca el promedio en dos y promediar por el método medio y el modo de línea unidireccional. Establezca la profundidad de bits en ocho bits. Defina la configuración de adquisición multidimensional para la conversión de Dendra2.
Para la conversión y el blanqueo, utilice el láser de diodo de 405 nanómetros establecido en 60% de potencia de energía. Seleccione una serie temporal de dos ciclos con un intervalo de 0,0 milisegundos entre los ciclos y un inicio y una parada normales. Establezca el blanqueo para que comience después de escanear uno de dos, para que se repita durante 30 iteraciones y para detenerse cuando la intensidad baje a 50%Entonces, defina la velocidad del píxel de adquisición que mora para la conversión rápida y a medio para capturar una imagen de ajuste.
Para montar los nematodos en las diapositivas, utilice un marcador permanente para dibujar y numerar una ventana con cuatro cuadrados en el opuesto de la almohadilla de agarosa en cada diapositiva. Agregue 15 microlitros de levamisol a la mitad de la almohadilla de agarosa y utilice un microscopio estéreo y una selección de alambre para transferirlos a nematodos coincidentes con la edad en la gota. Use un pico de pestañas para mover suavemente cada nematodo en una ventana del cuadrado.
Cuando todos los nematodos hayan sido reposicionados, espere hasta que los gusanos hayan dejado de moverse antes de colocar un resbalón de cubierta sobre el líquido para inmovilizar los nematodos durante la toma de imágenes. A continuación, coloque la diapositiva en la etapa del microscopio confocal. Para la conversión verde Dendra2, utilice el ocular del objetivo 20 X bajo fluorescencia verde para localizar el primer nematodo y centrarse en la cabeza o la cola.
Cambie al modo confocal y aumente o disminuya la ganancia y la potencia láser para obtener una imagen saturada, pero no sobreexpuesta. Dibuja una región de interés alrededor de la neurona seleccionada y dibuja una segunda región más grande de interés alrededor de la cola que incluya la primera región de interés. Establezca la primera región que se va a adquirir, blanquear y analizar.
Establezca la segunda región de interés que se va a adquirir y analizar, pero no blanquear. Establezca la velocidad de escaneo al máximo e inicie el escaneo para convertir las neuronas Dendra2 seleccionadas. Inmediatamente después de la conversión, comience a escanear en vivo con el láser verde de 561 nanómetros para visualizar Dendra2 en el canal rojo y encontrar el enfoque y la proyección máxima respectiva de la neurona convertida.
Ajuste rápidamente la velocidad de escaneo a una velocidad de permanencia de píxeles más baja y adquiera una imagen instantánea de ambos canales a una resolución más alta. Esta imagen se considera en el momento cero después de la conversión. A continuación, guarde el análisis con un nombre y un número identificables, seguido de la etiqueta de tiempo cero.
Para realizar un seguimiento de la degradación de Dendra2 a lo largo del tiempo, abra la imagen de tiempo cero de la neurona nematodara respectiva. Usando la misma configuración de imagen, comience a escanear en vivo en el canal rojo y ponga la neurona roja convertida en el foco. A continuación, sin cambiar ningún parámetro de adquisición, obtenga una instantánea a la misma velocidad que la primera imagen.
Asegúrese de definir su configuración de conversión cuidadosamente para convertir Dendra2 de manera eficiente y suficiente y para mantener los mismos parámetros de adquisición a lo largo de diferentes puntos de tiempo. Para analizar las imágenes Dendra2 convertidas, abra las imágenes de punto de tiempo cero y segundo en Fiji y abra Analizar y establecer mediciones. Seleccione las funciones Area y Integrated Density y seleccione la imagen obtenida con el canal rojo.
Usando la Herramienta Selección de Polígonos, dibuja una región de interés alrededor del tiempo cero neurona convertida. Para identificar correctamente los contornos de la neurona, seleccione Imagen, Ajustar y Umbral para resaltar los umbrales de intensidad. Una vez definida la selección, haga clic en Analizar y medir.
Aparecerá una ventana de resultados emergente, que incluye el área, la densidad integrada y los valores de densidad integrada sin procesar para la región de interés seleccionada. Realice el mismo proceso de selección y medición de la imagen desde el segundo punto de tiempo. A continuación, copie los valores en la hoja de cálculo.
En este análisis representativo antes de la conversión, ninguna señal roja era visible cuando la muestra se excitaba en el canal rojo. Tras la irradiación, la señal verde disminuyó a medida que se convertía HTT-D2 y posteriormente apareció una señal roja. La expresión HTT-D2 se degradó con el tiempo, lo que resultó en una reducción en los niveles de señal HTT-D2 roja y un posible aumento de la señal HTT-D2 verde a medida que se sintetizaba recientemente más proteína de fusión.
En particular, las neuronas de la región de la cola estaban determinadas a ser significativamente más activas en comparación con las de la cabeza. Además, hubo una degradación significativamente mayor del control HTTQ25-D2 24 horas después de la conversión, luego después de dos horas en las neuronas de la cabeza y la cola. Esta diferencia no se observó en HTTQ97-D2 patógeno, sin embargo, lo que sugiere que la red de proteostasis no pudo eliminar HTT-D2 que contenía tramos más largos de glutamina en todo el sistema nervioso.
HTTQ97-D2 no se degradó tan eficientemente como HTTQ25-D2 en nematodos muy viejos, destacando la incapacidad de la red de proteostasis para eliminar especies agregadas y posiblemente tóxicas de Huntingtin en animales mayores. Es importante destacar que las neuronas de cola fueron capaces de hacer frente a HTTQ97-D2 tóxico en nematodos jóvenes, lo que sugiere que varios mecanismos concomitantes de la red de proteostasis podrían estar trabajando para eliminar la HTT-D2. Para cada muestra, adquiera y no sobreexpuesta y no satura la imagen inmediatamente después de la conversión y reutilice la misma configuración para esa muestra a lo largo del tiempo.
Con este protocolo, es posible probar los cambios en una red de proteostatis, y también, con la ayuda de la microscopía de superresoridad, para rastrear la propagación de las proteínas asociadas a la enfermedad.
