פרוטוקול זה מאפשר מעקב וכמות של השפלה של חלבון של עניין חי ומזדקן C.elegans. טכניקה זו של vivo ו- noninvasive דורשת רק מיקרוסקופיה קטנה להגדיר כדי להמיר באופן אמין Dendra2 לתוך פלואורופור בהיר ויציב. השיטה מותאמת למערכות יונקים, כמו גם דגי זברה.
כדי ללמוד, לשים במחזור בתוך רשת פרוטאוסטטיס, כמו גם תחבורה וסחר. יש לדאוג לא לעורר המרה לא רצויה של Dendra2 בעת סריקה עם לייזר אור כחול, כדי לבדוק ולמטב את הגדרות הרכישה ואת הגדרות ההמרה עבור כל מערכת וחלבון היתוך. התחילו בגידול נמטודות תואמות גיל ב-20 מעלות צלזיוס לגיל הרצוי לניסוי.
ביום ניסוי ההדמיה, ההמסה הכללית עלתה בריכוז של 3% במים מזוקקים כפולים. בעוד אגרוז הוא קירור, לחתוך את הקצה של קצה פיפטה מיליליטר אחד כדי להקל על השאיפה של כ 400 microliters של אגרוז נמס. בזהירות להוסיף כמה טיפות של agarose על מגלשת זכוכית נקייה מיד למקם שקופית נוספת על גבי הטיפות כדי ליצור כרית דקה של agarose בין שתי חתיכות זכוכית.
כאשר ההתעוררות התייבשה, הסר בזהירות את השקופית העליונה. כאשר הוכנו מספיק שקופיות, פתח את תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקל והגדר את נתיב האור לגירוש ו הפליטה. עבור Dendra2 ירוק להוסיף 486 כדי 553 ננומטר, עבור אדום Dendra2 להוסיף 580 כדי 740 ננומטר.
התאימו את העוצמה וההתפתחות של שני הערוצים בהתאם לעוצמת הפלואורופור והגדירו את חור הסיכה לפתיחה מלאה. בחרו מצב ערוץ רציף והגדירו את הרצועה כך שתחליף כל פריים. הגדר את מצב הסריקה כמסגרת ואת גודל המסגרת כ- 1024 על 1024 עם שלב שורה של אחד.
הגדר את הממוצע לשניים ולממוצע לפי השיטה והאופן הממוצעים של קו חד-כיווני. הגדר את עומק הסיביות לשמונה סיביות. הגדר את הגדרת הרכישה הרב-מידנית עבור ההמרה של Dendra2.
להמרה והלבנה, השתמש בלייזר דיודה 405 ננומטר מוגדר 60% כוח אנרגיה. בחר סדרת זמן של שני מחזורים עם מרווח זמן של 0.0 אלפיות שניה בין המחזורים והתחלה ועיבור רגילים. הגדר את ההלבנה להתחיל לאחר סריקה אחת משתיים, לחזור על 30 איטראציות ולהפסיק כאשר העוצמה יורדת ל 50%לאחר מכן, להגדיר את המהירות של פיקסל הרכישה להתעכב מהר להמרה ובינונית ללכידת תמונת הצמדה.
כדי לטעון את nematodes על השקופיות, להשתמש בסמן קבוע לצייר ולמספר חלון עם ארבעה ריבועים על ההפך של כרית agarose על כל שקופית. הוסף 15 microliters של levamisole לאמצע כרית אגרוז ולהשתמש מיקרוסקופ סטריאו בחירה חוטית להעביר עבור nematodes תואם גיל לתוך טיפה. השתמש בפיק ריסים כדי להזיז בעדינות כל נמטודה לחלון אחד של הריבוע.
כאשר כל הנמטודות מוצבות מחדש, המתן עד שהתולעים יפסיקו לנוע לפני הנחת החלקת כיסוי על הנוזל כדי לשתק את הנמטודות במהלך ההדמיה. לאחר מכן, מקם את השקופית על שלב המיקרוסקופ הקונפוקל. להמרה ירוקה Dendra2, להשתמש בעין של המטרה 20 X תחת פלואורסצנטיות ירוקה כדי לאתר את nematode הראשון ולהתמקד בראש או בזנב.
עבור למצב confocal ולהגדיל או להקטין את הרווח ואת כוח הלייזר כדי להשיג תמונה רוויה, אך לא יתר על המידה. צייר אזור עניין סביב הנוירון שנבחר וצייר אזור עניין גדול יותר סביב הזנב הכולל את האזור הראשון של עניין. הגדר את האזור הראשון שיש לרכוש, להלבין ולנתח.
הגדר את האזור השני של עניין להיות נרכש וניתוח, אבל לא מולבן. הגדר את מהירות הסריקה למקסימום והתחל את הסריקה כדי להמיר את תאי העצב הנבחרים של Dendra2. מיד לאחר ההמרה, להתחיל סריקה חיה עם לייזר 561 ננומטר ירוק כדי לדמיין Dendra2 בערוץ האדום ולמצוא את המיקוד ואת ההקרנה המרבית בהתאמה של הנוירון המרה.
הגדר במהירות את קצב הסריקה למהירות נמוכה יותר של עכבות פיקסלים ורכוש תמונת מצב של שני הערוצים ברזולוציה גבוהה יותר. תמונה זו נחשבת בזמן אפס לאחר ההמרה. לאחר מכן, שמור את הסריקה בשם או במספר הניתנים לזיהוי, ולאחר מכן את תווית הזמן אפס.
כדי לעקוב אחר השפלה Dendra2 לאורך זמן, לפתוח את התמונה אפס פעמים של נוירון nematode בהתאמה. באמצעות אותה הגדרת תמונה, התחילו לסרוק בשידור חי בערוץ האדום והכניסו את הנוירון האדום שהומר לפוקוס. לאחר מכן, מבלי לשנות פרמטרי רכישה כלשהם, השג תמונה באותה מהירות כמו התמונה הראשונה.
הקפד להגדיר את הגדרת ההמרה שלך בקפידה כדי להמיר Dendra2 ביעילות ובאופן מספיק כדי לשמור על אותם פרמטרי רכישה לאורך נקודות זמן שונות. כדי לנתח את תמונות Dendra2 שהומרו, פתחו את תמונות נקודת הזמן אפס והזמן השני בפיג'י ופתחו את 'נתח' ו'קבע מידות'. בחרו בפונקציות 'אזור' ו'דחיסות משולבת' ובחרו בתמונה שהושגה בערוץ האדום.
בעזרת הכלי בחירת מצולע, צייר אזור מעניין בערך בזמן שבו אפס נוירון שהומר. לזיהוי נכון של קווי המתאר של הנוירון, בחרו 'תמונה', 'התאם' ו'סף' כדי לסמן את ספי העוצמה. לאחר הגדרת הבחירה, לחץ על נתח ולמדוד.
יופיע חלון תוצאות מוקפץ, כולל האזור, הצפיפות המשולבת וערכי הצפיפות המשולבת הגולמית עבור אזור העניין שנבחר. בצעו את אותו תהליך בחירה ומדידה לתמונה מנקודת הזמן השנייה. לאחר מכן, העתק את הערכים לגיליון האלקטרוני.
בניתוח מייצג זה לפני ההמרה, לא היה אות אדום גלוי כאשר המדגם התרגש בערוץ האדום. עם הקרנה, האות הירוק פחת כמו HTT-D2 הומר אות אדום לאחר מכן הופיע. ביטוי HTT-D2 התדרדר עם הזמן, וכתוצאה מכך ירידה ברמות של אות HTT-D2 אדום עלייה אפשרית של אות HTT-D2 ירוק כמו חלבון היתוך יותר היה מסונתז לאחרונה.
יש לציין, הנוירונים של אזור הזנב נקבעו להיות פעילים יותר באופן משמעותי בהשוואה לאלה של הראש. יתר על כן, הייתה השפלה משמעותית יותר של שליטה HTTQ25-D2 24 שעות לאחר ההמרה, ולאחר שעתיים הן נוירונים הראש והזנב. הבדל זה לא נצפתה HTTQ97-D2 פתוגניים, עם זאת, מה שמרמז כי רשת פרוטאוסטאזיס לא היתה מסוגלת להסיר HTT-D2 המכיל מתיחות גלוטמין ארוכות יותר בכל מערכת העצבים.
HTTQ97-D2 לא היה מושפל ביעילות כמו HTTQ25-D2 ב nematodes הישן מאוד, הדגשת חוסר היכולת של רשת פרוטאוסטיס להסיר מינים מצטברים ואולי רעילים של הנטינגטון בבעלי חיים מבוגרים. חשוב לציין, נוירונים זנב הצליחו להתמודד עם HTTQ97-D2 רעילים ב nematodes צעירים, מה שמרמז כי מנגנוני רשת פרוטאוסטזיס במקביל שונים עשויים להיות בעבודה כדי להסיר HTT-D2. עבור כל רכישה לדוגמה ותמונה שאינה מוסברת יתר על כן ותמונה לא רוויה מיד לאחר ההמרה ותיוו לעשות שימוש חוזר באותה הגדרה עבור מדגם זה לאורך זמן.
עם פרוטוקול זה, ניתן לבדוק שינויים ברשת פרוטאוסטטיס, וגם, בעזרת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, כדי לעקוב אחר התפשטות של חלבונים הקשורים למחלות.
