إعداد الأنسجة القلبية المهندسة على شكل شبكة مشتقة من خلايا iPS البشرية لإصلاح عضلة القلب في فيفو

يصف هذا البروتوكول طريقة نبيلة وسهلة لإنشاء أنسجة قلبية هندسية على شكل شبكة مشتقة من أجزاء الجسم المستحثة البشرية وخلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية. المرونة في هندسة الأنسجة وقابلية توسعية وظيفة الأنسجة المحفوظة هي المزايا الرئيسية لهذه التقنية. يمكن لـ ECTs شكل الشبكة المزروع استعادة بنية القلب ووظيفته في نموذج احتشاء عضلة القلب الفئران.

التأكد من جدواها للاستخدام في العلاج التجديدي القلبي. تتطلب هذه التقنيات معالجة خلايا STEM البشرية القابلة للتكرار ومهارات زراعة الأنسجة لتحقيق نتائج متسقة. تبدأ بقطع ورقة PDMS الشفاء إلى الحجم المناسب للسماح ورقة لتكون مستعبدة مع لاصق سيليكون لتصنيع 21 في 20.5 ملليمتر علبة مستطيلة مع سبعة ملليمتر طويلة 0.5 ملليمتر واسعة و 2.5 ملليمتر وظائف مستطيلة عالية في وضعية متداخلة.

يجب أن يكون التباعد الأفقي بين خطين من الوظائف 2.5 ملليمتر. اُمَكف الصلبة بـ 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل طلاء القالب بـ 1٪ Poloxamer 407 في PBS لمدة ساعة واحدة. ثم شطف جيدا القالب مع برنامج تلفزيوني ووضع القالب في بئر واحد من لوحة ستة جيدا.

لتحليل النسب، والجمع بين الخلايا من القلب بالإضافة إلى البروتوكولات الخلايا جدارية البطانية والأوعية الدموية. بحيث يكون التركيز النهائي للخلايا الجدارية 10 إلى 20٪ في عدد الخلايا الإجمالية من ست مرات 10 إلى الخلايا الست لكل بناء. مزيج 133 ميكرولترات من حمض قابل للذوبان الجرذان الكولاجين نوع واحد حل و 17 ميكرولترات من العازلة القلوية إلى 17 ميكرولترات من 10X الحد الأدنى المتوسطة الأساسية على الجليد.

ثم إضافة 67 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى حل الكولاجين. المقبل، الطرد المركزي الخلايا وإعادة تعليق بيليه في 167 ميكرولترات من ارتفاع الجلوكوز دوليبيككو الحد الأدنى الأساسية المتوسطة تكملها مصل البقر الجنين والمضادات الحيوية. خلط الخلايا على حل المصفوفة على الجليد.

ثم صب بعناية 400 ميكرولترات من تعليق مصفوفة الخلية على بولوإكسامر 407 المغلفة PDMS العفن الأنسجة. احتضان خليط مصفوفة الخلية في حاضنة ثقافة الخلايا القياسية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 60 دقيقة. عندما تكون الأنسجة قد تشكلت، نقع بعناية العفن مع أربعة ملليلتر من ECT ثقافة المتوسطة والعودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 14 يوما.

قبل زرع العلاج بالصدمات الكهربائية، قمت بتعقيم ملقط غرامة لإزالة بعناية العلاج بالصدمات الكهربائية من وظائف التحميل. يمكن أن تكون ملفقة قوالب الأنسجة مع أنماط مختلفة، وأطوال آخر والتباعد ما بعد لتوليد هندسة العلاج بالصدمات الكهربائية النهائي مختلفة. لهذا التحليل، تم استخدام قالب مع سبعة وظائف ملليمتر طويلة مع 2.5 ملليمتر فواصل واسعة.

Poloxamer 407 يمنع التصاق الخلايا بالعفن وتمكن من تشكيل بنية شبكة مميزة ، بعد ضغط هلام سريع في 14 يومًا. يتم الحفاظ على هيكل حتى بعد تحرير العلاج بالصدمات الكهربائية من القالب. بناء الأنسجة المفبركة هو ما يقرب من 1.5 سم واسعة و 0.5 ملليمتر سميكة.

وعرض كل حزمة في شبكة هو ما يقرب من 0.5 ملليمتر في المتوسط. فمن الممكن لتوليد 3 سم النهائي عرض شبكة ECT التي تحتوي على 24 مليون خلية من العفن أربع مرات أكبر مع نفس متداخلة آخر التصميم. ويمكن أيضا أن هذا أكبر شبكة العلاج بالصدمات الكهربائية يمكن إزالتها بسهولة من القالب ويولد فعل المحلية للقوة ما يعادل أصغر ECT شبكة.

من المهم صب خليط مصفوفة الخلية بالتساوي في قالب الأنسجة دون توليد فقاعات لمنع عيوب الشعور في الجل النهائي. توصيف وظيفي للمتعاقد. ويمكن تنفيذ علاقات التردد الرابعة باستخدام أنظمة مدمجة.

هدفنا النهائي هو ترجمة نماذج العلاج بالصدمات الكهربائية إلى علاجات سريرية تستخدم دراسات حيوانية كبيرة قبل السريرية.