פרוטוקול זה מתאר שיטה אצילית וקלה ליצירת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת המופקות מחלקי גוף הנגרמים על ידי בני אדם ותאי לב שמקורם בתאי STEM. הגמישות של הגיאומטריה של הרקמה ואת המדרגיות של תפקוד הרקמה השתמר הם היתרונות העיקריים של טכניקה זו. ה- ECTs של צורת רשת מושתלת יכול לשחזר מבנה לב ולתפקד במודל אוטם שריר הלב של חולדה.
אישור היתכנותו לשימוש בטיפול רגנרטיבי לב. טכניקות אלה דורשות עיבוד תאי STEM אנושיים לשחזור ואת כישורי תרבות הרקמה לקבלת תוצאות עקביות. התחל על ידי חיתוך גיליון PDMS נרפא לגודל המתאים כדי לאפשר את הגיליון להיות מלוכדות עם דבק סיליקון כדי לפברק מגש מלבני 21 על ידי 20.5 מילימטר עם שבעה מילימטר ארוך 0.5 מילימטר רוחב ו 2.5 מילימטר גבוה עמדות מלבניות בתנופים מתנדנדים.
המרווח האופקי בין שתי שורות עמודים צריך להיות 2.5 מילימטרים. סעו אוטומטית במגש ב-120 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לפני ציפוי התבנית ב-1%Poloxamer 407 ב-PBS למשך שעה. לאחר מכן שוטפים ביסודיות את התבנית עם PBS ומ מניחים את התבנית לתוך באר אחת של צלחת שש בארות.
לניתוח שושלת היוחסין, שלבו את התאים מהקרדיומיוציט בתוספת פרוטוקולי תאי קיר אנדותל וסקולריים. כך שהריכוז הסופי של תאי קיר הוא 10 עד 20% במספר תאים כולל של שש פעמים 10 לש ששת התאים לכל מבנה. מערבבים 133 מיקרוליטרים של קולגן זנב עכברוש מסיס חומצה סוג אחד ו 17 microliters של מאגר אלקלי ל 17 microliters של 10X מינימום חיוני בינוני על קרח.
לאחר מכן הוסיפו 67 מיקרוליטרים של מטריצת קרום המרתף לפתרון הקולגן. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים resuspend את גלולה ב 167 microliters של בינוני חיוני מינימלי של גלוקוז Dulbecco גבוה בתוספת סרום חזיר עוברי ואנטיביוטיקה. מערבבים את התאים על פתרון המטריצה על הקרח.
ואז בזהירות לשפוך 400 microliters של ההשעיה מטריצת התא על פולוקסאמר 407 מצופה עובש רקמת PDMS. אין לארוב את תערובת מטריצת התאים באינקובטור סטנדרטי לתרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 60 דקות. כאשר הרקמה נוצרה, בזהירות להשרות את התבנית עם ארבעה מיליליטר של מדיום תרבות ECT ולהחזיר את הצלחת אינקובטור תרבות התא במשך 14 ימים.
לפני השתלת ECT, אתה מעקר מטלאים עדין כדי להסיר בזהירות את ECT מן עמדות הטעינה. תבניות רקמות ניתן להמציא עם דפוסים שונים, אורכי פוסט ומרווח פוסט כדי ליצור גיאומטריות ECT סופיות שונות. לניתוח זה נעשה שימוש בתבנית עם עמדות באורך שבעה מילימטרים עם מרווחים ברוחב 2.5 מילימטר.
Poloxamer 407 מונע הידבקות של התאים לתבנית ומאפשר היווצרות של מבנה רשת אופייני, לאחר דחיסת ג'ל מהירה בתוך 14 ימים. המבנה נשמר גם לאחר ECT הוא שוחרר מן התבנית. מבנה הרקמה המפוברק הוא ברוחב של כ-1.5 ס"מ ועוביו 0.5 מילימטרים.
והרוחב של כל חבילה רש הוא כ 0.5 מילימטרים בממוצע. ניתן ליצור רשת שינוי ברוחב סופי של 3 ס"מ המכילה 24 מיליון תאים מתבנית גדולה פי ארבעה עם אותו עיצוב פוסט מתנדנד. זה ECT רשת גדולה יותר ניתן גם להסיר בקלות מן התבנית ומייצר פעולה מקומית של כוח שווה ערך ECT רשת קטנה יותר.
חשוב לשפוך את תערובת מטריצת התא באופן שווה לתוך תבנית הרקמה מבלי ליצור בועות כדי למנוע תחושת פגמים בג'ל הסופי. אפיון תפקודי של הקבלן. ו ניתן לבצע קשרי תדר רביעי באמצעות מערכות מובנות.
המטרה הסופית שלנו היא תרגום פרדיגמות ECT לטיפולים קליניים המשתמשים במחקרים פרה-קליניים גדולים בבעלי חיים.
