Preparazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di mesh derivati da cellule iPS umane per la riparazione miocardia in Vivo

Questo protocollo descrive un metodo nobile e facile per creare tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di rete derivati da parti del corpo indotte dall'uomo e cellule cardiache derivate da cellule STAMINALI. La flessibilità della geometria tissutale e la scalabilità della funzione tissutale preservata sono i principali vantaggi di questa tecnica. Gli ECT a forma di rete impiantata possono ripristinare una struttura cardiaca e funzionare in un modello di infarto miocardico del ratto.

Confermandone la fattibilità per l'uso in terapia rigenerativa cardiaca. Queste tecniche richiedono l'elaborazione riproducibile delle cellule STAMINALI umane e le capacità di coltura tissutale per risultati coerenti. Iniziare tagliando un foglio PDMS polimerizzato alle dimensioni appropriate per consentire di legare il foglio con adesivo in silicone per fabbricare un vassoio rettangolare di 21 per 20,5 millimetri con una larghezza di 0,5 millimetri lunga sette millimetri e pali rettangolari alti 2,5 millimetri in posizioni sfalsate.

La spaziatura orizzontale tra due linee di pali dovrebbe essere di 2,5 millimetri. Autoclavare il vassoio a 120 gradi Celsius per 20 minuti prima di rivestire lo stampo con 1%Poloxamer 407 in PBS per un'ora. Quindi sciacquare accuratamente lo stampo con PBS e posizionare lo stampo in un unico pozzo di una piastra a sei poi.

Per l'analisi del lignaggio, combina le cellule del cardiomiocita più protocolli cellulari murali endoteliali e vascolari. Quindi la concentrazione finale di cellule murali è dal 10 al 20% in un numero totale di cellule di sei per 10 fino alle sei celle per costrutto. Mescolare 133 microlitri di soluzione di collagene Acid Soluble Rat Tail di tipo uno e 17 microlitri di Alkali Buffer a 17 microlitri di 10X Minimum Essential Medium sul ghiaccio.

Quindi aggiungere 67 microlitri di Matrice di membrana basale alla soluzione di collagene. Successivamente, centrifugare le cellule e rimescolare il pellet in 167 microlitri del Medium essenziale minimo di Alto glucosio Dulbecco integrato con siero bovino fetale e antibiotici. Mescolare le cellule sulla soluzione matriciale sul ghiaccio.

Quindi versare con cura 400 microlitri della sospensione della matrice cellulare sullo stampo in tessuto PDMS rivestito poloxamer 407. Incubare la miscela di matrice cellulare in un incubatore di coltura cellulare standard a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 60 minuti. Quando il tessuto si è formato, immergere con cura lo stampo con quattro millilitri di mezzo di coltura ECT e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare per 14 giorni.

Prima dell'impianto ECT, è stato sterilizzato le forcep fini per rimuovere con cura l'ECT dai posti di carico. Gli stampi tissutali possono essere fabbricati con vari motivi, lunghezze di palo e spaziatura post per generare diverse geometrie ECT finali. Per questa analisi è stato utilizzato uno stampo con pali lunghi sette millimetri con intervalli di 2,5 millimetri di larghezza.

Poloxamer 407 previene l'adesione delle cellule allo stampo e consente la formazione di una caratteristica struttura a rete, dopo una rapida compattazione del gel in 14 giorni. La struttura viene mantenuta anche dopo che l'ECT è stato rilasciato dallo stampo. Il costrutto di tessuto fabbricato è largo circa 1,5 centimetri e spesso 0,5 millimetri.

E la larghezza di ogni fascio nella rete è di circa 0,5 millimetri in media. È possibile generare un ECT a rete finale di 3 centimetri contenente 24 milioni di celle da uno stampo quattro volte più grande con lo stesso design del palo sfalsato. Questo ECT a rete più grande può anche essere facilmente rimosso dallo stampo e genera un atto di forza locale equivalente alla rete più piccola ECT.

È importante versare uniformemente la miscela della matrice cellulare nello stampo tissutale senza generare bolle per evitare difetti di sensazione nel gel finale. Caratterizzazione funzionale del contraente. e le relazioni di quarta frequenza possono essere eseguite utilizzando sistemi integrati.

Il nostro obiettivo finale è la traduzione dei paradigmi ECT in terapie cliniche che utilizzano grandi studi preclinici sugli animali.