وأيد هذا العمل من قبل المحقق بوروز ويلكوم لجائزة YM وزمالة براون Coxe بعد الدكتوراة من جامعة ييل لMD.

المواد : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة بروتين -- الليزوزيم (50 ملغ / مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شنق 24 قطرة جيدا صينية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجلس جيدا انخفاض 24 علبة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microbatch تبلور 96 علبة جيدا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلورة حلول (إما التجارية المتاحة أو المنزل الذي أدلى) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السيليكون الشحوم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 مل حقنة دون Luer القفل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الشرائح Siliconized </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الشريط الضوئي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البارافين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0،1-2 micropipette ميكرولتر مع الاحتفاظ المنخفض نصائح </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاقيط </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مناديل المهنية </li></ul> 1. معلقة / يجلس إسقاط الإجراءات : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على شاشة الأولي يمكن للمرء أن استخدام الشاشات المتوفرة تجاريا التي تستغل مصفوفة كاملة متفرق الأسلوب مضروب ظروف المحاكمة. غير منحازة مصفوفة كاملة متفرق مضروب من قبل وطريقة اختيارهم من الشروط المعروفة للتبلور جزيئات (كارتر وكارتر ، 1979 ؛ Cudney وآخرون ، 1994 ؛. Jancarik وكيم ، 1991 ؛. Jancarik وآخرون ، 1991). إذا كان من المعروف مسبقا حالة التبلور ، يمكن تجميعها شاشة ضيقة ، بدرجات تركيز الرواسب ودرجة الحموضة في جميع أنحاء ضرب الأصلي. ومرسب أنجح شيوعا هو البولي ايثيلين جلايكول (PEG) ، تليها سلفات الأمونيوم. معا ، هذه precipitants حساب اثنين من أجل ما يقرب من 60 ٪ من جميع الجزيئات precipitants المسجلة المستخدمة لبلورة (جيليلاند وآخرون ، 1994 ؛. كيمبر وآخرون ، 2003 ؛. صفحة وآخرون ، 2003). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول بلورة الخاص. وعادة ما يتم الجمع بين هذه الظروف من وكيل عجل ، والملح من نوع ما وعازلة لضبط درجة الحموضة. قد يكون في بعض الحالات واضاف المضافة خصيصا لهذا البروتين في المصالح. ينبغي تصفيتها حل جميع الأسهم باستخدام 0.22 ميكرون التصفية. ربما بعض من محلول المخزون تكون لزجة جدا (50 ٪ أوتاد ، الجلسرين ، PEG - MME ، الخ). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1.5 مل من 0.6 ، 0.8 ، 1.0 ، 1.2 ، 1.4 ، 1.6 م في كل من كلوريد الصوديوم 0.1 درجة الحموضة NaOAc M 4.0 ، 4.3 ، 4.6 و 4.9 (حلول مجموعه 24) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أذاب عينتك البروتين والحفاظ على الجليد. يجب أن يتم تخزينها في مخزونات البروتين -80 درجة مئوية ما لم البروتين ذات الاهتمام حساس لتجميد / دورات الذوبان (إذا كان الأمر كذلك ، وتخزينها في 4 درجات مئوية). تركيزات البروتين النموذجية هي في حدود 50-50 ملغ / مل ، مع ارتفاع تركيزات عادة إعطاء أفضل النتائج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور العينة 15min/18 ، 000xg / 4 درجات مئوية -- تميل بعض البروتينات لتجميع جزئيا ويعجل بعد خطوة ذوبان الجليد. ويمكن تعزيز هذه المجاميع هطول الأمطار غير متبلور من بقية الجزيئات البروتينية لذا تدور باستمرار شامل يضمن لديك سوى جزيئات تذوب في عينتك. إبقاء البروتين على الجليد حتى إعداد الدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز البروتين من الامتصاصية أعمالها في 280 نانومتر باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية. ويمكن حساب تركيز البروتين من القراءة الامتصاصية ومعامل البروتين الانقراض. ويمكن حساب معامل الانقراض مع أداة ProtParam على موقع Expasy : <a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تملأ الآبار من جانب شنقا 24 / علبة قطرة الجلوس مع 500 ميكرولتر من محلول مرسب وفقا لخطة الإعداد علبة (الشكل 2B). إنشاء عصابة الشحوم سيليكون حول حافة البئر. وينبغي أن يكون حلقة فجوة صغيرة لمنع تراكم الضغط الجوي كما هو مختومة البئر. قطرات في الجلوس ، وليس هناك حاجة لأن الشحوم لاغلاق جيدا مع الشريط (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ شريحة الغطاء وتنظيفه مع رذاذ الهواء المكثف ، أو مسح المهنية -- تجنب الغبار سيخفف تفسير انخفاض التلوث والقضاء على التبلور. قطرات للجلوس ، لا يتم استخدام الشريحة الغطاء. بدلا من ذلك ، كذلك يحتوي على الرف الذي يتم خلط البروتين ومرسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح كميات متساوية من العينة البروتين وخزان حل على الشريحة الغطاء. لا يجوز محاكمة أحجام مختلفة من البروتين ومرسب كجزء من عملية التحسين. استخدام المزيد من البروتين من النتائج مرسب في تركيز صافي البروتين في الانخفاض بعد موازنة ، التي يمكن أن يكون من المرغوب فيه للحصول على عينات البروتين المخففة ، وإبطاء التنوي الكريستال أو النمو. وسيتم أيضا أي مادة أخرى غير قلق في حل قطرة أن تتركز من قبل العامل نفسه. عندما pipetting البروتين والحلول الخزان على الشريحة الغطاء ، نكون حذرين للغاية لتجنب تكوين الفقاعة. هذا يحدث غالبا عندما يتم نفخ الهواء من ماصة. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطرة شنقا : تحميل 2 ميكرولتر من 50 ملغ / مل الليزوزيم 0.02 درجة الحموضة في NaOAc M 4.9 إلى وسط تغطية الشريحة وإضافة إلى ذلك 2 ميكرولتر من الحل الخزان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجلس قطرة : تحميل 2 ميكرولتر من 50 حل الليزوزيم ملغ / مل إلى مركز للجرف وإضافة إلى ذلك 2 ميكرولتر من محلول الخزان. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه تغطية الشريحة بلطف وأضعها على الحلقة الشحوم على رأس البئر. اضغط لأسفل برفق حتى أن الهواء لا يمكن الخروج من البئر خلال الشق في الشحوم في العلاقات العامةحدث تراكم الضغط الجوي في البئر والحفاظ على مختوم بشكل جيد. يمكن الضغط الجوي تراكم في البئر رفع غطاء الشريحة ، المساس ختم جيدا. في أسلوب إسقاط الجلوس ، ويتم استخدام الشريط الشفاف واضح بصريا لتغطية الآبار. وبالتالي ، سيكون في هذا الختم الأسلوب تجري كل صف / عمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتقال إلى البئر المقبل حتى علبة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من درج على الإعداد -- القضاء على جزيئات الغبار والملوثات الأخرى يمكن أن تقلل من هوية مزورة إيجابية من بلورات البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ورقة التسجيل للوثيقة تجربتك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الدرج عند درجة حرارة الحضانة المطلوب ، عموما ما بين 4 درجات حرارة مئوية وغرفة درجة. 20 درجة مئوية هو أنجح شائع. الحرص على التعامل مع علبة بلطف وتجنب أي اهتزاز. كن حذرا أثناء فتح وإغلاق الباب الحاضنة. يمكن الاهتزازات أو التغيرات في درجات الحرارة أثناء النقل أو الحضانة منع نمو البلورات أو تؤثر سلبا على نوعية الكريستال. ويمكن استخدام مواد لامتصاص الصدمات (مثل رغوة التعبئة) والحشو تحت الأدراج الكريستال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من علبة للبلورات في اليوم التالي ، ومن ثم كل بضعة أيام ، والمناولة دائما الأدراج مع الرعاية. أي وثيقة النتائج وmorphologies انخفاض في التهديف ورقة علبة معينة. البلورات تأخذ عادة 2-5 أيام لتظهر ، على الرغم من بلورات تظهر أحيانا في وقت أقرب بكثير (على الفور تقريبا) أو في وقت لاحق (تصل إلى عدة أشهر!). مرة واحدة وقد تم تحديد شروط التبلور وكما هو معروف أن معدل نمو البلورات ، فمن الأفضل أن تترك دون عائق الأدراج حتى بلورات ظهرت ونمت على الأقل لنصف حجمها النهائي. يمكن ترك الأدراج دون عائق خفض عدد الأحداث التنوي الكريستال ، وبالتالي إنتاج أعداد أقل من أكبر البلورات. </li></ol> 2. Microbatch الداخلي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصف بأنها نموذج البروتين وإعداد مرسب أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رذاذ الهواء microbatch صينية جديدة لتجنب الغبار والجزيئات الكبيرة الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في علبة microbatch ، وملء زيت البرافين تصل إلى 3 مم (ما يكفي لتغطية الآبار). إزالة الوصول للنفط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 1 ميكرولتر من محلول البروتين (50 ملغ / مل الليزوزيم) في مرحلة ما قبل النفط مملوءة جيدا -- تأكد من ماصة الحل مباشرة إلى قاع البئر (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 1 ميكرولتر من محلول مرسب في فقا جيدا إلى علبة مخطط الإعداد (الشكل 2B) -- تأكد هبوط المصارف إلى قاع البئر والصمامات مع قطيرة البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتقال إلى البئر المقبل حتى علبة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات من 11-14 من الشنق / يجلس الإجراء الهبوط. </li></ol> 3. ممثل النتائج : ويشار عادة إلى بلورة مثل عنق الزجاجة من البلورات بالأشعة السينية. مصفوفة كاملة متفرق الشاشة مضروب ظروف عجل تنتج عادة من أنواع مختلفة من تجميع البروتين وهطول الأمطار ، من بينها بلورات واحدة كبيرة. إذا كان البروتين أو مرسب تركيزات مرتفعة للغاية ويمكن للمرء أن يرى المسألة البني مع أي شكل مميز وحجم (التساقط غير متبلور). عند التشبع الحل ، فإن الهبوط غالبا ما تكون واضحة تماما وخالية من أي نوع لهطول الأمطار. ويبين الشكل 3 أمثلة عديدة لهطول الأمطار والظواهر بلورات (ديساو وآخرون ، 2006). ويمكن الاطلاع على مزيد من ظواهر هطول الأمطار مع تفسير أكثر تفصيلا في <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a> . <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. مبدأ بلورة البروتين. مبدأ بلورة البروتين. في تجربة نشر البخار (أ) وحدات التخزين على قدم المساواة مرسب والبروتينات موجودة في الانخفاض. ومنتشر خارج المياه ، وسيتم مضاعفة كل من الرواسب وتركيز البروتين حتى يتم تحقيق التوازن بين الدراسة والحل الخزان. في التبلور الدفعي (B) ومرسب وتركيز البروتين لا تتغير أثناء التجربة. بدأت بلورات البروتين التنوي يحدث ، لتشكيل وتركيز البروتين في حل قطرات من التشبع -- النقطة أ -- إقامة التشبع البروتين يمكن أن تتكون بلورات أي وباء نقطة. نقطة C -- بروتين رواسب ، ولكن قد البلورات ما زالت تنمو ، توصيل هلام (C) بلورة غسيل الكلى باستخدام الشعرية. بلورات الملح تظهر كما ينشر من العينة البروتين (و / أو ينشر مرسب في عينة بروتين) عبر المكونات هلام. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. مخطط نموذجي التجارب بلورة البروتين. (أ) إجراءات لتعليق نشر انخفاض بخار ، ويجلس انخفاض بخار نشرها ، وتبلور microbatch البروتين. في كل حالة ، يتم خلط كمية صغيرة من البروتين عينة مركزة مع حجم مساو أو أصغر من precipitanر حل وسمح للتوازن. (B) لبلورة الليزوزيم الدجاج ، علبة 24 جيد تم إعداده مع تركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم (لمرسب) وخلات الصوديوم بنسبة 0.1 M باعتبارها منطقة عازلة في مختلف PHS (4،0-4،9). <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. نتائج نموذجية من البروتين تجربة التبلور. (أ) التساقط غير متبلور. عندما البروتين أو مرسب (أو كليهما) في تركيز عال. (ب) فصل المرحلة. قد البروتين أو المنظفات منفصلة لمرحلة مختلفة عند مزجه مع precipitants معينة في تركيز عال. (C) على شكل بلورات البروتين رود AtCSN7 من الحصول عليها في 8000 والبولي ايثيلين جلايكول المغنيسيوم خلات (ديساو وآخرون ، 2006). (D) بلورات الليزوزيم في الحصول على 1،0 M كلوريد الصوديوم وخلات الصوديوم الهيدروجيني 4.9. (ه) تحت قطرات مشبعة تبقى عادة واضحة. التصوير الفوتوغرافي من قبل موشيه ديساو.

<ol>
	<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).</li><li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments.">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li><li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth.">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li><li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+(CSN7).">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li><li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Macromolecule+Crystallization+Database,+Version+3.0:+new+features,+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data.">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li><li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+matrix+sampling:+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins.">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li><li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li><li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+mining+crystallization+databases:+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens.">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li><li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+growth+of+proteins,+nucleic+acids,+and+viruses+in+gels.">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallization of biological macromolecules. , (1999).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li><li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics:+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome.">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نحن في هذه المقالة وصف وشرح البروتوكولات العام الجاري لبلورة البروتين. منذ أن الإجراء متعددة خطوة هناك بعض الاعتبارات يحتاج المرء أن يكون على علم. عند العمل مع كميات صغيرة جدا (0،5-2 ميكرولتر) ، والتجفيف للانخفاض بسبب التبخر هو مصدر قلق كبير. وبالتالي ، فمن المستحسن للع...

<table><tbody><tr><td>Lysozyme</td><td></td><td>Sigma-aldrich</td><td>L6876-1G</td></tr><tr><td>24 well VDX Plate</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-142</td></tr><tr><td>24 well Cryschem Plate</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td></tr><tr><td>Dow Corning Vacuum Grease</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-510</td></tr><tr><td>Siliconized glass circle coverslides</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td></tr><tr><td>100% paraffin oil</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-411</td></tr><tr><td>1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-511</td></tr><tr><td>96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate)</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-098</td></tr></tbody></table>

protein crystallization for x-ray crystallography

باستخدام هيكل ثلاثى الابعاد لجزيئات بيولوجية لاستنتاج كيفية عملها هو واحد من أهم مجالات البيولوجيا الحديثة. توافر هياكل ذرية القرار يوفر فهما عميقا وفريدة من نوعها وظيفة البروتين ، ويساعد على كشف الأعمال الداخلية للخلية الحية. حتى الآن ، 86 ٪ من بنك معلومات البروتين (rcsb - PDB) الإدخالات هياكل الجزيئات التي تم تحديدها باستخدام الأشعة السينية البلورات. للحصول على بلورات المناسبة للدراسة البلورات ، ويجب أن جزيء (بروتين مثل الحمض النووي ، ومعقدة البروتين البروتين أو البروتينات والحمض النووي معقد) يمكن تنقيته لالتجانس ، أو أقرب ما يمكن إلى التجانس. تجانس إعداد يشكل عاملا رئيسيا في الحصول على البلورات التي حيد الضوء إلى ارتفاع القرار (Bergfors ، 1999 ؛ ماكفرسون ، 1999). يتطلب بلورة يصل إلى جزيء فوق التشبع. ولذلك ينبغي أن تتركز العينة إلى تركيز أعلى درجة ممكنة من دون التسبب في سقوط الأمطار أو تجميع للجزيء (عادة 20-50 ملغ / مل). ويمكن تقديم نموذج لتعزيز عامل عجل التنوي من البلورات البروتينية في الحل ، والذي يمكن أن يؤدي إلى بلورات ثلاثي الأبعاد الكبيرة المتزايدة من الحل. هناك نوعان من التقنيات الرئيسية للحصول على بلورات : بخار نشر وبلورة الدفعي. نشر في بخار ، وانخفاض تحتوي على خليط من حلول مرسب والبروتين هو في غرفة مغلقة مع مرسب النقي. ثم ينشر بخار الماء من الانخفاض حتى الأسمولية من الانخفاض ومرسب متساوون في (الشكل 1A). والجفاف من الانخفاض البطيء يؤدي إلى تركيز كل من البروتين ومرسب حتى يتحقق التوازن ، مثالي في منطقة التنوي الكريستال من المخطط المرحلة. الأسلوب يعتمد على تقديم دفعة البروتين مباشرة في منطقة التنوي بواسطة بروتين الاختلاط مع كمية مناسبة من مرسب (1B الشكل). عادة ما يتم إجراء هذه الطريقة في ظل البارافين / خليط المعادن النفطية للحيلولة دون انتشار المياه من الهبوط. هنا سوف نظهر نوعين من الإعداد لنشر بخار التجريبية ، والشنق قطرة قطرة ، والجلوس ، وبالإضافة إلى بلورة إطار الدفعة النفط.

Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitat...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Crystallization for X-ray Crystallography at JoVE.com

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

هيكل 3 - D من جزيء يوفر فريدة من فهم كيفية عمل الجزيء. الأسلوب الرئيسي للتقرير في بنية شبه الذرية القرار البلورات بالأشعة السينية. هنا ، علينا أن نظهر أن الأساليب الحالية للحصول على بلورات ثلاثي الأبعاد للجزيء أي بالنظر إلى أن تكون مناسبة لتحديد الهيكل بواسطة البلورات بالأشعة السينية.

البلورة البروتين لالبلورات بالأشعة السينية

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biology

63.3K Views.  Yale University. هيكل 3 - D من جزيء يوفر فريدة من فهم كيفية عمل الجزيء. الأسلوب الرئيسي للتقرير في بنية شبه الذرية القرار البلورات بالأشعة السينية. هنا ، علينا أن نظهر أن الأساليب الحالية للحصول على بلورات ثلاثي الأبعاد للجزيء أي بالنظر إلى أن تكون مناسبة لتحديد الهيكل بواسطة البل...

Video: Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize proteins, DNAs, RNAs, and their complexes can however not be predicted. Employing a broad variety of conditions is a way to increase the yield of quality diffraction crystals. Two fully automated systems have been developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, England, MRC-LMB) that facilitate crystallization screening against 1,920 initial conditions by vapor diffusion in nanoliter droplets. Semi-automated protocols have also been developed to optimize conditions by changing the concentrations of reagents, the pH, or by introducing additives that potentially enhance properties of the resulting crystals. All the corresponding protocols will be described in detail and briefly discussed. Taken together, they enable convenient and highly efficient macromolecular crystallization in a multi-user facility, while giving the users control over key parameters of their experiments.

Automated systems and protocols for the routine preparation of a large number of screens and nanoliter crystallization droplets for vapor diffusion experiments are described and discussed.

الآلي البروتوكولات لبلورة الجزيئات في لجنة نهر الميكونج مختبر البيولوجيا الجزيئية

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in their largest dimension, which used to represent a challenge. We present two alternative workflows for the structure determination of protein microcrystals by X-ray crystallography with a particular focus on crystals grown in vivo. The microcrystals are either extracted from cells by sonication and purified by differential centrifugation, or analyzed in cellulo after cell sorting by flow cytometry of crystal-containing cells. Optionally, purified crystals or crystal-containing cells are soaked in heavy atom solutions for experimental phasing. These samples are then prepared for diffraction experiments in a similar way by application onto a micromesh support and flash cooling in liquid nitrogen. We briefly describe and compare serial diffraction experiments of isolated microcrystals and crystal-containing cells using a microfocus synchrotron beamline to produce datasets suitable for phasing, model building and refinement.
These workflows are exemplified with crystals of the Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin produced by infection of insect cells with a recombinant baculovirus. In this case study, in cellulo analysis is more efficient than analysis of purified crystals and yields a structure in ~8 days from expression to refinement.

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

A protocol is presented for X-ray crystallography using protein microcrystals. Two examples analyzing in vivo-grown microcrystals after purification or in cellulo are compared.

الجريزوفولفوغرافيا من بلورات البروتين و<em&gt; في سيليولو</em&gt; الانعراج

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

التبلور والتصميم الهيكلي للانزيم: مجمع الركيزة بواسطة البلورات التسلسلية في رقاقة Microfluidic متعددة الاستخدامات

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins on-chip with the dialysis method and allowing in situ single-crystal or serial crystallography experiments at room temperature. The protocol details the fabrication process of the microchips, the manipulation of the on-chip crystallization experiments and the treatment of the in situ collected X-ray diffraction data for the structural elucidation of the protein sample. The main feature of this microfabrication procedure lies on the integration of a commercially available, semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane in between two layers of the chip. The molecular weight cut-off of the embedded membrane varies depending on the molecular weight of the macromolecule and the precipitants. The device exploits the advantages of microfluidic technology, such as the use of minute volumes of samples (&#60;1 &#181;L) and fine tuning over transport phenomena. The chip coupled them with the dialysis method, providing precise and reversible control over the crystallization process and can be used for investigating phase diagrams of proteins at the microliter scale. The device is patterned using a photocurable thiolene-based resin with soft imprint lithography on an optically transparent polymeric substrate. Moreover, the background scattering of the materials composing the microchips and generating background noise was evaluated rendering the chip compatible for in situ X-ray diffraction experiments. Once protein crystals are grown on-chip up to an adequate size and population uniformity, the microchips can be directly mounted in front of the X-ray beam with the aid of a 3D printed holder. This approach addresses the challenges rising from the use of cryoprotectants and manual harvesting in conventional protein crystallography experiments through an easy and inexpensive manner. Complete X-ray diffraction data sets from multiple, isomorphous lysozyme crystals grown on-chip were collected at room temperature for structure determination.

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This paper details the fabrication protocol of microfluidic chips developed for on-chip protein crystallization with the dialysis method and in situ X-ray diffraction experiments. The microfabrication process makes it possible to integrate a semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane with any molecular weight cut-off, between two layers of the chip.

تبلور البروتينات على رقاقة عن طريق المجهر دراسات الحيود في الموقع بالأشعة السينية

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Chemistry

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since cryogenic temperatures are non-physiological and may prevent, deter, or even alter protein structural dynamics, a robust method for routine X-ray diffraction experiments at room temperature is highly desirable. The crystal-on-crystal device and its accompanying hardware and software used in this protocol are designed to enable in situ X-ray diffraction at room temperature for protein crystals of different sizes without any sample manipulation. Here we present the protocols for the key steps from device assembly, on-chip crystallization, optical scanning, crystal recognition to X-ray shot planning and automated data collection. Since this platform requires no crystal harvesting nor any other sample manipulation, hundreds to thousands of protein crystals grown on chip can be introduced into an X-ray beam in a programmable and high-throughput manner.

This contribution describes how to set up protein crystallization on crystal-on-crystal devices and how to perform automated serial data collection at room temperature using the on-chip crystallization platform.

التبلور على الرقاقة والحيود التسلسلي واسع النطاق في درجة حرارة الغرفة

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug discovery. To date, X-ray crystallography remains the most successful method for solving three-dimensional protein structures at atomic resolution. With recent advances in serial crystallography, either using X-ray free electron lasers (XFELs) or synchrotron light sources, protein crystallography has progressed to the next frontier, where the ability to acquire time-resolved data provides important mechanistic insights into the behavior of biological molecules at room temperature. This protocol describes a straightforward high-throughput (HTP) workflow for screening crystallization conditions through the use of a 96-well dialysis plate. These plates follow the Society for Biomolecular Screening (SBS) standard and can be easily set up using any standard crystallization laboratory. Once optimal conditions are identified, large quantities of crystals (hundreds of microcrystals) can be produced using the dialyzer. To validate the robustness and versatility of this approach, four different proteins were crystallized, including two membrane proteins.

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

The presented protocol describes a straightforward approach for screening protein crystallization conditions and crystal growth using a 96-well high-throughput dialysis plate. The use of dialyzer tubes for the large-scale growth of microcrystals is also demonstrated for serial crystallography and MicroED applications.

تبلور البروتين عالي الإنتاجية عن طريق غسيل الكلى

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

فحص عالي الإنتاجية لبلورة البروتين

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into an ordered lattice amenable to diffraction remains challenging. The crystallization of biomolecules is largely experimentally defined, and this process can be labor-intensive and prohibitive to researchers at resource-limited institutions. At the National High-Throughput Crystallization (HTX) Center, highly reproducible methods have been implemented to facilitate crystal growth, including an automated high-throughput 1,536-well microbatch-under-oil plate setup designed to sample a wide breadth of crystallization parameters. Plates are monitored using state-of-the-art imaging modalities over the course of 6 weeks to provide insight into crystal growth, as well as to accurately distinguish valuable crystal hits. Furthermore, the implementation of a trained artificial intelligence scoring algorithm for identifying crystal hits, coupled with an open-source, user-friendly interface for viewing experimental images, streamlines the process of analyzing crystal growth images. Here, the key procedures and instrumentation are described for the preparation of the cocktails and crystallization plates, imaging the plates, and identifying hits in a way that ensures reproducibility and increases the likelihood of successful crystallization.

تسليط الضوء على المؤلف: فحص عالي الإنتاجية للحصول على ضربات الكريستال لعلم بلورات البروتين  

This protocol details high-throughput crystallization screening, ranging from the 1,536 microassay plate preparation to the end of a 6 week experimental time window. Details are included about the sample setup, the imaging obtained, and how users can perform analyses using an artificial intelligence-enabled graphical user interface to quickly and efficiently identify macromolecular crystallization conditions.

فحص عالي الإنتاجية للحصول على نتائج بلورية لعلم بلورات البروتين

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

بلورة البروتين الآلي وجمع البيانات في الوقت الحقيقي

Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source

Protocols for robotic protein crystallization using the Crystallization Facility at Harwell and in situ room temperature data collection from crystallization plates at Diamond Light Source beamline VMXi are described. This approach enables high-quality room-temperature crystal structures to be determined from multiple crystals in a straightforward manner and provides very rapid feedback on the results of crystallization trials as well as enabling serial crystallography. The value of room temperature structures in understanding protein structure, ligand binding, and dynamics is becoming increasingly recognized in the structural biology community. This pipeline is accessible to users from all over the world with several available modes of access. Crystallization experiments that are set up can be imaged and viewed remotely with crystals identified automatically using a machine learning tool. Data are measured in a queue-based system with up to 60&#176; rotation datasets from user-selected crystals in a plate. Data from all the crystals within a particular well or sample group are automatically merged using xia2.multiplex with the outputs straightforwardly accessed via a web browser interface.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير تحليل بنية البروتين لتطوير الأدوية 

We present a protocol for the crystallization of proteins using the crystallization facility in the Research Complex at Harwell and subsequent in situ X-ray crystallographic data collection from crystals within the plates at Diamond&#39;s Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline. We describe sample requirements, crystallization protocols, and data collection guidelines.

البلورة البروتين لالبلورات بالأشعة السينية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

الآلي البروتوكولات لبلورة الجزيئات في لجنة نهر الميكونج مختبر البيولوجيا الجزيئية

الجريزوفولفوغرافيا من بلورات البروتين و

التبلور والتصميم الهيكلي للانزيم: مجمع الركيزة بواسطة البلورات التسلسلية في رقاقة Microfluidic متعددة الاستخدامات

تبلور البروتينات على رقاقة عن طريق المجهر دراسات الحيود في الموقع بالأشعة السينية

التبلور على الرقاقة والحيود التسلسلي واسع النطاق في درجة حرارة الغرفة

تبلور البروتين عالي الإنتاجية عن طريق غسيل الكلى

فحص عالي الإنتاجية للحصول على نتائج بلورية لعلم بلورات البروتين

فحص عالي الإنتاجية للحصول على نتائج بلورية لعلم بلورات البروتين

فحص عالي الإنتاجية للحصول على نتائج بلورية لعلم بلورات البروتين

التبلور وجمع بيانات درجة حرارة الغرفة في الموقع باستخدام مرفق التبلور في Harwell و Beamline VMXi ، مصدر ضوء الماس