Este trabajo fue apoyado por la subvención GM118085 de los Institutos Nacionales de Salud y en parte por la Fundación Robert Welch (subvención F-1811 a R.M.H.).

1. Aislamiento de mutantes supresores en cepas deficientes en motilidad
Nota : utilice este método como un amplio 'catch-all' para identificar la naturaleza general del defecto de motilidad.
<ol><li>Preparación de placas de agar blando NOTA: El agar blando, también conocido como motilidad o agar nadador, es un agar de bajo porcentaje (~ 0.2-0.35% p / v), utilizado durante mucho tiempo para ensayar quimiotaxis31,32.<ol>
<li>Añadir 3 g de bacto-agar (0,3% p/v) y 20 g de LB a un matraz inferior redondo de 2 L. Añadir 1 L de ddH2O (agua doble destilada) al matraz y mezclar uniformemente la suspensión utilizando una varilla de agitación y una placa de agitación magnética.</li>
		<li>Autoclave durante 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Dejar enfriar con agitación suave usando la varilla / placa como arriba. Cuando la temperatura alcance aproximadamente 50 °C, vierta 25 mL en placas de Petri estériles (100 mm x 15 mm), y deje que el agar fundido se ajuste con la tapa en su lugar durante al menos 1 h, para su uso dentro de 16 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de cultivo, inoculación y aislamiento de mutantes supresores NOTA: E. coli inoculada en el centro de medios ricos en nutrientes solidificados con agar blando consumen nutrientes localmente, creando un gradiente de nutrientes que siguen. A medida que se mueven hacia el exterior, aparecen "anillos" definidos (Figura 1A), que están relacionados con quimioatrayentes específicos a los que responden las bacterias. Los defectos en el sistema de quimiotaxis o los componentes estructurales del motor de flagelos pueden comprometer el rendimiento en este ensayo. A menudo, los mutantes con una ventaja de motilidad surgen durante el cribado, y se pueden ver emergiendo de puntos únicos o múltiples a lo largo de la periferia del anillo, desde donde 'estallan' hacia fuera (Figura 1C). Uno notará que el borde más externo del frente de natación contrasta fácilmente con el agar suave virgen no colonizado.<ol>
<li>Cultivar durante la noche cultivos de la cepa deficiente en motilidad deseada en 5 mL de Caldo Lennox (LB; 10 g/L triptona, 5 g/L de extracto de levadura, y 5 g/L de NaCl, Tabla de Materiales)a 30 °C con agitación horizontal (220 r.p.m.). Al día siguiente, sub-cultivo (dilución 1:100) en LB fresco, creciendo en las mismas condiciones a fase exponencial (OD600 de 0,6).</li>
		<li>Inocular 6 μL del cultivo en el centro de una placa de agar blando (1.1) usando una pipeta, empujando la punta estéril cargada en el agar para expulsar suavemente el contenido. Transferir a 30 °C e incubar (Figura 1B), hasta que la motilidad 'brotes' son evidentes, emanando del punto de inoculación o de la periferia de los anillos de motilidad, típicamente en 24-36 h (Figura 1C). NOTA: En ensayos de motilidad, inocular una cepa de tipo salvaje junto con los aislados mutantes para la comparación. Esta cepa de tipo salvaje mostrará los anillos quimiotácticos concéntricos característicos(Figura 1A)y llenará la placa dentro de 8-10 h.</li>
		<li>Use un lazo de alambre estéril para levantar las células de la región de "llamarada" y la raya para purificar colonias individuales en una placa de agar duro LB (LB preparado como el anterior, solidificado con 15 g / L bacto-agar).</li>
		<li>Recoger colonias individuales de la placa de raya utilizando un bucle de alambre estéril y volver a purificar por rayas para colonias individuales para asegurar el aislamiento de un aislado de colonia "pura".</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmación, y caracterización de mutantes supresores
	<ol>
<li>Confirme que los mutantes supresores aislados han restaurado la motilidad. Preparar placas de agar blando (1.1) y cultivos para cepas de interés (como en 1.2.1), incluyendo el tipo salvaje y la cepa inicial "deficiente en motilidad" para la comparación.</li>
		<li>Inocular las placas (como en 1.2.2) e incubar a 30 °C durante 8-10 h.</li>
		<li>Registre el diámetro del anillo más externo (borde del círculo) y compare para establecer cuál de los aislados ha restaurado sustancialmente la motilidad. NOTA: Se recomienda que las placas sean fotografiadas a lo largo del tiempo-curso del experimento. Para obtener los mejores resultados, utilice un dispositivo de "cubo de luz"30,donde se monta una cámara digital sobre una fuente de luz para una mejor iluminación para medir el diámetro de la colonia de natación y distinguirla del agar no colonizado.</li>
		<li>El tema verificó aislantes a WGS según lo requerido, permitiendo suficiente " cobertura de la secuencia" para identificar positivamente las mutaciones que restauraron el salvaje-tipo función.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cuantificación del comportamiento motor de los flagelos a través del atado celular
Nota : utilice este método cuando el comportamiento normal de correr-caída (quimiotaxis) parece estar comprometido.
<ol><li>
Preparación del cultivo y esquila de flagelos
	<ol>
<li>Preparar un cultivo de fase exponencial de la cepa de interés como se describe en el paso 1.2.1.</li>
		<li>Pellet 10 mL de células por centrifugación a 2.000 x g durante 3 min antes de resuspender en 10 mL de Tampón de Motilidad esterilizado por filtro (MB; tampón de fosfato de potasio de 10 mM [0,0935 M K2HPO4,0,0065 M KH2PO4,pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). NOTA: MB apoya la motilidad, pero no apoya el crecimiento bacteriano</li>
		<li>Repetir el paso 2.1.2 dos veces más antes de volver a gastar el pellet final en 1 mL de MB.</li>
		<li>Transfiera la suspensión celular a una jeringa de 1 ml y coloque una aguja de 23G al extremo. Monte un aparato idéntico de jeringa/aguja y coloque los dos juntos a través de 6 pulgadas de tubo de polietileno (diámetro interior de 0,58 mm) firmemente envainado sobre cada punta de aguja.</li>
		<li>Esquile los flagelos (son frágiles y se rompen fácilmente) pasando suavemente la suspensión celular de un lado a otro de una jeringa a la otra 50x, con 1 min de pausa entre cada 10 pasadas.</li>
		<li>Centrifugar las células cizalladas a 2.000 x g durante 3 min y resuspend en un volumen final de 500 μL de MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de diapositivas y atado celular
	<ol>
<li>Prepare una cámara de fijación celular apilando una cubierta de 18 mm x 18 mm sobre una corredera de microscopio de vidrio de 3 pulgadas x 1 pulgada x 1 mm, separada por cinta adhesiva de doble cara (Figura S1).</li>
		<li>Enjuague la cámara con solución de poli-lisina al 0,01% (p/v) aplicándola en la parte superior de la cámara. Incline el borde inferior (el cubrebocas al ras con la corredera del microscopio) sobre un limpiaparabrisas de tarea (papel tisú) para ayudar a dibujar la solución a través de la cámara (Figura S1). Luego incubar a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
		<li>Lavar la cámara tres veces con 40 μL de MB utilizando como se describe en el paso 2.2.2</li>
		<li>Añadir 40 μL de la suspensión de células cizalladas (preparada arriba) en la parte superior de la cámara e incubar a temperatura ambiente durante 10 min para permitir que las células se adhieran al cubrebocas.</li>
		<li>Enjuague suavemente la cámara con 40 μL de MB como en 2.2.3 para eliminar las células no unidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Registro y cuantificación de la rotación celular
	<ol>
<li>Transfiera el portaobjetos del microscopio cargado con células atados a la etapa del microscopio.</li>
		<li>Usando microscopía de contraste de fase y un objetivo de 100x, escanee la población en busca de células que estén fijas en su lugar, y gire en un solo eje, es decir, rotaciones suaves en un punto fijo en lugar de presentarse en un ángulo en el que la célula se mueva dentro y fuera del enfoque (Video 1).</li>
		<li>Utilice un microscopio comercial y una cámara asociada. Abra el software asociado, asegúrese de que las celdas de interés estén enfocadas y haga clic en adquisición de video para grabar la rotación de celdas durante un minuto (a 10 cuadros por segundo o más).</li>
		<li>A partir de la reproducción de vídeo, cuantifique el número de rotaciones completas por minuto y el número de veces que la celda cambia de dirección (frecuencia de conmutación). NOTA: Las velocidades de rotación y la frecuencia de conmutación pueden ser demasiado rápidas para medir a simple vista, por lo que se recomienda utilizar un software de vídeo que ofrezca una reproducción lenta/fina, o que adopte un sistema de software automatizado para cuantificar los patrones de rotación33. Una alternativa sería aumentar la viscosidad del MB usando metilcelulosa (o agente similar) para ayudar a ralentizar y resolver la rotación de bacterias más rápidas o compensar cuando se utilizan cámaras con bajas tasas de fotogramas.</li>
		<li>Repita el paso 2.3.2 con réplicas biológicas para compilar una representación de la población de interés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparación de enjambres en un ensayo de cruce de fronteras
NOTA: Utilice este método para evaluar el impacto de una mutación o condición en la motilidad del grupo. Enjambre-agar se refiere al agar donde el porcentaje es típicamente más alto que el del agar blando. En el agar blando (0,3 %), las células nadan individualmente dentro del agar. En el agar enjambre (0,5% y más), las células se mueven como un grupo en la superficie. Mientras que las placas de enjambre deben usarse como se detalla aquí, las placas de natación tienen una vida útil más larga y se pueden usar durante varios días. Nuestra preferencia personal es utilizar en 1-2 días.
<ol><li>
Preparación del agar enjambre
	<ol>
<li>Añadir 5 g de agar Eiken (0,5% p/v) y 20 g de LB a un matraz inferior redondo de 2 L. Añadir 1 L de ddH2O al matraz y mezclar uniformemente la suspensión utilizando una varilla de agitación y una placa de agitación magnética.</li>
		<li>Autoclave durante 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Deje enfriar con una agitación suave para evitar cualquier burbuja de aire usando la varilla / placa como se indicó anteriormente. Cuando sea aproximadamente 50 °C, añadir glucosa esterilizada por filtro para una concentración final del 0,5 %.</li>
		<li>Verter 25 mL en placas de Petri estériles (100 mm x 15 mm) y dejar fijar a temperatura ambiente durante al menos 14 h y no más de 20 h. No almacenar para uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inoculación e incubación de placas de enjambre
	<ol>
<li>Inocular 6 μL de un cultivo exponencial medio (preparado como en 1.2) manchando en la parte superior del agar.</li>
		<li>Deje la tapa apagada durante 5-10 minutos y reemplácela cuando el inóculo se haya secado en la superficie del agar.</li>
		<li>Incubar a 30 °C durante 8 h. Evite la tentación de inspeccionar el progreso del enjambre quitando la tapa, ya que esto contribuirá al secado del agar y perjudicará el enjambre. NOTA: El tiempo de incubación puede variar dependiendo del fenotipo de la cepa. Algunas mutaciones aisladas pueden dificultar la capacidad de enjambre y requerirán un porcentaje reducido de agar o un período más prolongado de incubación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de placas de ensayo para cruzar la frontera NOTA: Este ensayo utiliza una placa de Petri modificada, donde una división plástica (borde) crea dos cámaras, en lugar de una(Figura 2A). Cada cámara se puede preparar independientemente de la otra, ofreciendo diferentes condiciones para el enjambre, antes de 'conectar' los dos. Dependiendo del diseño experimental, la primera cámara (designada a la izquierda) se puede preparar con agar de baño (0.3% p/v) o agar de enjambre (0.5% p/v) desde donde las bacterias pueden migrar a través de la frontera hacia la cámara derecha que contiene agar enjambre +/- cualquier suplemento o desafío requerido (por ejemplo, antibióticos). La migración en cualquiera de los agares se mide/compara típicamente registrando el diámetro más ancho de la colonización bacteriana (de borde a borde) desde el punto original de inoculación.<ol>
<li>Prepare el agar para nadar como se describe en 1.1 si es necesario.</li>
		<li>Preparar el agar enjambre como se describe en 3.1.</li>
		<li>Verter ~ 30 mL de agar enjambre (con la suplementación deseada si es necesario) en la cámara derecha de una placa de Petri de doble compartimento (100 mm x 15 mm), hasta el punto en que esté nivelado con el divisor de plástico entre las cámaras, pero no desbordando hacia la izquierda (Figura 2B).</li>
		<li>Después de que el agar se haya endurecido, llene la cámara izquierda con ~ 30 mL de agar de baño o enjambre, de nuevo hasta el punto de contacto con la división de plástico (Figura 2C). Antes de que se establezca, utilice una punta de pipeta estéril para arrastrar suavemente el agar sobre el borde para conectar los dos lados con un puente de agar de ~ 1 mm de altura que abarca toda la longitud de la división (Figura 2D).</li>
		<li>Dejar secar la placa a temperatura ambiente (3.1). NOTA: Un método alternativo de creación de puente es permitir que el agar de la cámara izquierda se seque y luego pipetee lentamente ~ 100 μL de agar enjambre fundido a lo largo del divisor de plástico para unir las dos cámaras (3.4). Inocular las placas en la cámara izquierda como se detalla anteriormente para nadar (1.2.2) o enjambre (3.2) agar, antes de incubar a 30 °C durante 12-16 h, o hasta que los enjambres hayan progresado lo suficiente sobre la cámara derecha para permitir comparaciones entre cepas de interés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El aislamiento y caracterización de mutaciones supresoras han contribuido con éxito a identificar componentes clave del sistema de quimiotaxis35,36,37,así como la propia maquinaria motora38,39,40. Durante el uso del Protocolo 1, es importante incluir múltiples réplicas independientes para asegurar el aislamiento de un amplio espect...

Las bacterias emplean muchos apéndices para el movimiento y la dispersión en sus nichos ecológicos1. La motilidad impulsada por flagelos es la más rápida de ellas, promoviendo la colonización de localizaciones favorables en respuesta a las señales ambientales, y contribuyendo significativamente a la capacidad patógena de algunas especies2,3. Las bacterias flageladas pueden nadar individualmente en líquido a granel, o enjambre como un colectivo sobre una superficie semisó sólida4. Los flagelos extracelulares se unen y son accionados por motores rotativos incrustados en la membrana, que aprovechan la potencia de los gradientes iónicos para generar un par que provocala rotación 1,2,4,5,6,7,8. En E. coli,cuyos motores funcionan a un par constantede 9,la salida del motor se puede clasificar en términos de velocidad de rotación y conmutación del rotor entre las direcciones en sentido contrario a las agujas del reloj (CCW) y en el sentido de las agujas del reloj (CW). La rotación CCW promueve la formación de un haz flagelar coherente que impulsa la célula hacia adelante (run), mientras que un interruptor transitorio en dirección rotacional (CW) hace que el haz se desmonte parcial o totalmente10,y la célula reoriente su dirección de natación (caída). E. coli típicamente corre por un segundo y cae por una décima de segundo. La frecuencia de conmutación del rotor o 'sesgo de caída' es controlada por el sistema de señalización quimiotaxis, en el que los quimiorreceptores transmembrana detectan señales químicas externas y las transmiten a través de fosforelay al motor flagelar para extender las corridas en respuesta a los atrayentes, o suprimirlas en respuesta a productos químicos tóxicos11,12. La motilidad de natación se ensaya en agar blando al 0,3%.
Durante el enjambre, las bacterias navegan en una superficie semisólida como un colectivo denso, donde los paquetes de bacterias fluyen en un movimiento continuo de remolino2,13,14,15. Los enjambres de E. coli exhiben fisiología quimiosensorial alterada (menor sesgo de caída), velocidades más altas y mayor tolerancia a los antimicrobianos sobre las células que nadan en líquido a granel16,17. Los enjambres varían en su despliegue de una gran cantidad de estrategias que ayudan al movimiento, incluyendo la producción de surfactante, hiperflagelación y elongación celular2. El enjambre ofrece a las bacterias una ventaja competitiva tanto en entornos ecológicos como clínicos18,19,20. Hay dos categorías de bacterias de enjambre: enjambres templados, que pueden enjambre sólo en medios solidificados con 0,5-0,8% de agar, y enjambres robustos, que pueden navegar a través de concentraciones de agar más altas21.
Existe una variedad de ensayos para interrogar la motilidad de la natación y su regulación. Cuando se ve afectada por mutaciones o condiciones ambientales, la motilidad en sí misma ofrece una fuerte selección para identificar mutaciones supresoras de ganancia de función. Estos supresores pueden ser revertientes genuinos de la mutación original, o pseudo-revertores, donde una segunda mutación restaura la funcionalidad. Tales mutantes pueden ser identificados por secuenciación del genoma completo (WGS). Una alternativa a la selección imparcial del supresor es una estrategia sesgada de la mutagénesis apuntada (e.g., mutagénesis de la polimerización en cadena). Estas metodologías a menudo arrojan luz sobre la función o la regulación ambiental del aparato de motilidad. Si el objetivo es estudiar la función motora, entonces la restauración de la motilidad de tipo salvaje medida en agar blando puede no indicar necesariamente la restauración de la salida del motor de tipo salvaje. El ensayo de atado celular, en el que las células se unen a una superficie de vidrio por un solo flagelo y la rotación del cuerpo celular se supervisa posteriormente, puede ser el ensayo inicial de elección para evaluar el comportamiento motor. Aunque ahora se dispone de metodologías más sofisticadas para supervisar las propiedades del motor, la configuración requerida de la cámara de alta velocidad y la aplicación de paquetes de software para el análisis de movimiento limitan su uso generalizado22,23,24,25. El ensayo de atado celular requiere solo que los flagelos estén cortados, lo que permite la unión de los filamentos cortos a un portaobjetos de vidrio, seguido de grabar en video la rotación del cuerpo celular. Aunque las velocidades registradas del motor sean bajas en este ensayo debido a la alta carga que el cuerpo celular ejerce sobre el flagelo, este ensayo ha contribuido sin embargo a información valiosa sobre las respuestas quimiotácticas26,27,28,29,y sigue siendo una herramienta de investigación válida como se discute a continuación.
La motilidad del enjambre plantea un conjunto diferente de desafíos a los investigadores. La selección de supresores de ganancia de función sólo funciona en enjambres que producen tensioactivos copiosos y enjambres fácilmente13. Los no productores de surfactantes como E. coli son exigentes con respecto a la elección del agar, la composición de los medios y la humedad del ambiente2,13,14,21. Una vez que se establecen las condiciones de enjambre, el ensayo de cruce de fronteras17 es una metodología útil para interrogar la capacidad de un enjambre para navegar por condiciones nuevas / duras. Aunque los protocolos presentados a continuación se relacionan con E. coli,pueden ser fácilmente adaptados para su aplicación en otras especies.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken agar</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>Essential for E. coli swarming</td></tr><tr><td>Glucose D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td>410955000</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Or equivalent software for microscope used</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm diameter)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For soft-agar assays</td></tr><tr><td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>Perkin Elmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>For border-crossing assays</td></tr><tr><td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Task/Tissue wipes</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Or equivalent single use tissue wipes</td></tr><tr><td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 camera</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Or equivalent microscope camera</td></tr></tbody></table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

La motilidad es crucial para la supervivencia y el éxito de muchas especies bacterianas. Existen muchas metodologías para explotar la motilidad para comprender las vías de señalización, para dilucidar la función y el ensamblaje de las partes flagelares, y para examinar y comprender los patrones de movimiento. Aquí demostramos una combinación de tres de estas metodologías. La motilidad en el agar blando es la más antigua, ofreciendo una fuerte selección para aislar las mutaciones supresoras de ganancia de función en cepas con problemas de motilidad, donde la motilidad se restaura a través de una segunda mutación. La técnica de atado celular, empleada por primera vez para demostrar la naturaleza rotatoria del motor flagelar, se puede utilizar para evaluar el impacto de los efectores de señalización en la velocidad del motor y su capacidad para cambiar la dirección de rotación. El ensayo de "cruce de fronteras" es más reciente, donde las bacterias nadadoras se pueden preparar para la transición a moverse colectivamente como un enjambre. En combinación, estos protocolos representan un enfoque sistemático y poderoso para identificar los componentes de la maquinaria de motilidad, y para caracterizar su papel en diferentes facetas de la natación y el enjambre. Se pueden adaptar fácilmente para estudiar la motilidad en otras especies bacterianas.

El aislamiento de pseudo-revertores en una cepa de E. coli cuya motilidad se ve afectada por altos niveles de la molécula de señalización c-di-GMP, fue detallado en un trabajo reciente de nuestro laboratorio34. Esta cepa (JP1442) albergaba dos mutaciones: ΔyhjH y ΔycgR. YhjH es la fosfodiesterasa más activa que degrada c-di-GMP en E. coli. La ausencia de YhjH conduce a niveles elevados de c-di-GMP y a la inhibición de la motilidad. YcgR es un efector c-di...

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Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Muchas bacterias utilizan la motilidad provocada por flagelos para navegar por su entorno y colonizar entornos favorables tanto individualmente como colectivamente. Aquí se demuestra el uso de tres métodos establecidos que explotan la motilidad como una herramienta de selección para identificar componentes / vías que contribuyen a la natación y la motilidad de enjambre.

Investigación De La Motilidad Impulsada Por Flagelos En Escherichia coli mediante la Aplicación De Tres Técnicas Establecidas En Una Serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.5K vistas.  The University of Texas at Austin. Muchas bacterias utilizan la motilidad provocada por flagelos para navegar por su entorno y colonizar entornos favorables tanto individualmente como colectivamente. Aquí se demuestra el uso de tres métodos establecidos que explotan la motilidad como una herramienta de selección para identificar componentes / vías que contribuyen a la natación y la motilidad de enjambre.

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Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizar solo los complejos moleculares En Vivo Uso de microscopía de fluorescencia avanzada

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Investigación

Biología

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Un dispositivo de microfluidos para la cuantificación de la quimiotaxis bacteriana en gradientes de concentración estable

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

Cuantificación de la motilidad del enjambre de la superficie bacteriana en placas de gradiente inductoras

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Bioquímica

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

La visualización de Contracciones Motilidad y caracterización del papel de la<em&gt; Pilg</em&gt; en<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Inmunología e Infección

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Análisis de una sola molécula de motores de la familia Kinesin-3 superprocesiva purificada Sf9

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Medición continua del ruido biológico en Escherichia Coli mediante microscopía de lapso de tiempo

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Bioingeniería

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

Generación de mutantes nulos para dilucidar el papel de las glicosiltransferasas bacterianas en la motilidad bacteriana

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Preparación, Imaging, y cuantificación de la superficie bacteriana Motilidad ensayos

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Caracterización biofísica de las funciones de motor flagelar

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

Visualización de la motilidad bacteriana basada en una reacción de color

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...