Ce travail a été soutenu par la subvention GM118085 des National Institutes of Health et en partie par la Fondation Robert Welch (subvention F-1811 à R.M.H.).

1. Isolement des mutants suppresseurs dans des souches déficientes en motilité
REMARQUE: Utilisez cette méthode comme un large « fourre-tout » pour identifier la nature générale du défaut de motilité.
<ol><li>Préparation de plaque de gélose molle REMARQUE: Soft-agar, également appelé motility- ou swim-agar, est une gélose à faible pourcentage (~ 0,2-0,35% p / v), longtemps utilisée pour analyser la chimiotaxie31,32.<ol>
<li>Ajouter 3 g de bacto-agar (0,3 % p/v) et 20 g de LB dans une fiole inférieure ronde de 2 L. Ajouter 1 L de ddH2O (eau doublement distillée) dans le ballon et mélanger uniformément la suspension à l’aide d’une tige d’agitation et d’une plaque d’agitation magnétique.</li>
		<li>Autoclave pendant 20 min à 121 °C.</li>
		<li>Laisser refroidir avec une agitation douce en utilisant la tige / plaque comme ci-dessus. Lorsque la température atteint environ 50 °C, verser 25 mL dans des boîtes de Petri stériles (100 mm x 15 mm) et laisser la gélose fondue se mettre en place avec un couvercle en place pendant au moins 1 h, pour une utilisation dans les 16 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de la culture, inoculation et isolement des mutants suppresseurs REMARQUE: E. coli inoculé au centre des milieux riches en nutriments solidifiés avec une gélose molle consomme des nutriments localement, créant un gradient de nutriments qu’ils suivent. Lorsqu’ils se déplacent vers l’extérieur, des « anneaux » définis apparaissent (figure 1A), qui sont liés à des chimioattractants spécifiques auxquels les bactéries répondent. Les défauts dans le système de chimiotaxie ou les composants structurels du moteur de flagelle peuvent compromettre la représentation dans cette analyse. Souvent, les mutants avec un avantage de motilité apparaissent pendant le criblage, et peuvent être vus émergeant d’un seul ou de plusieurs points le long de la périphérie de l’anneau, d’où ils « s’évasent »(Figure 1C). On remarquera que le bord extérieur du front de natation contraste facilement avec la gélose douce vierge non cloonisée.<ol>
<li>Cultiver pendant la nuit des cultures de la souche déficiente en motilité souhaitée dans 5 mL de bouillon Lennox (LB; 10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure et 5 g/L de NaCl, Table des matériaux)à 30 °C avec une secousse horizontale (220 p.r.m.). Le lendemain, sous-culture (dilution 1:100) en LB frais, poussant dans les mêmes conditions jusqu’en phase exponentielle (DO600 de 0,6).</li>
		<li>Inoculer 6 μL de la culture au centre d’une plaque de gélose molle (1.1) à l’aide d’une pipette, en poussant la pointe stérile chargée dans la gélose pour expulser doucement le contenu. Transférer à 30 °C et incuber(figure 1B),jusqu’à ce que des « éruptions » de motilité soient évidentes, émanant du point d’inoculation ou de la périphérie des anneaux de motilité, généralement en 24-36 h(figure 1C). NOTA : Dans les essais de motilité, inoculer une souche de type sauvage à côté des isolats mutants à des fins de comparaison. Cette souche de type sauvage montrera les anneaux chimiotactiques concentriques caractéristiques (figure 1A) et remplira la plaque dans les 8-10 h.</li>
		<li>Utilisez une boucle métallique stérile pour soulever les cellules de la région de la « torche » et des stries pour purifier les colonies individuelles sur une plaque de gélose dure LB (LB préparée comme ci-dessus, solidifiée avec 15 g / L bacto-agar).</li>
		<li>Choisissez des colonies uniques dans la plaque de strie à l’aide d’une boucle de fil stérile et purifiez à nouveau en stries pour les colonies uniques afin d’assurer l’isolement d’un isolat de colonie « pur ».</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmation et caractérisation des mutants suppresseurs
	<ol>
<li>Confirmer que les mutants suppresseurs isolés ont restauré la motilité. Préparer des plaques de gélose molle (1.1) et des cultures pour les souches d’intérêt (comme au point 1.2.1), y compris la souche de type sauvage et la souche de départ « déficiente en motilité » à des fins de comparaison.</li>
		<li>Inoculer les plaques (comme au point 1.2.2) et incuber à 30 °C pendant 8 à 10 h.</li>
		<li>Notez le diamètre de l’anneau le plus à l’extérieur (bord du cercle) et comparez-le pour établir lequel des isolats a substantiellement restauré la motilité. NOTA : Il est recommandé de photographier les plaques tout au long de l’expérience. Pour de meilleurs résultats, utilisez un dispositif « seau de lumière »30, où un appareil photo numérique est monté au-dessus d’une source de lumière pour un meilleur éclairage afin de mesurer le diamètre de la colonie de nage et de la distinguer de la gélose non colonisée.</li>
		<li>Le sujet a vérifié des isolats au WGS au besoin, tenant compte de la « couverture d’ordre » suffisante pour identifier positivement les mutations qui ont reconstitué la fonction de type sauvage.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Quantification du comportement moteur des flagelles via l’attache cellulaire
Remarque : utilisez cette méthode lorsque le comportement normal run-tumble (chimiotaxie) semble être compromis.
<ol><li>
Préparation de la culture et cisaillement des flagelles
	<ol>
<li>Préparer une culture en phase exponentielle de la souche d’intérêt comme décrit à l’étape 1.2.1.</li>
		<li>Granulé 10 mL de cellules par centrifugation à 2 000 x g pendant 3 min avant remise en suspension dans 10 mL de tampon de motilité stérilisé par filtre (MB; tampon phosphate de potassium 10 mM [0,0935 MK2HPO4 , 0,0065 MKH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], NaCl 10 mM, 75 mM KCl). REMARQUE: MB prend en charge la motilité, mais ne prend pas en charge la croissance bactérienne</li>
		<li>Répéter l’étape 2.1.2 deux autres fois avant de reprendre la pastille finale dans 1 mL de Mo.</li>
		<li>Transférer la suspension cellulaire dans une seringue de 1 mL et fixer une aiguille 23G à la fin. Assemblez une seringue ou un appareil à aiguille identique et fixez les deux ensemble au moyen de 6 pouces de tube en polyéthylène (diamètre intérieur de 0,58 mm) bien gainés sur chaque pointe d’aiguille.</li>
		<li>Cisaillez les flagelles (ils sont fragiles et se cassent facilement) en passant doucement la suspension cellulaire d’une seringue à l’autre 50x, avec 1 minute de pauses entre tous les 10 passages.</li>
		<li>Centrifuger les cellules cailleuses à 2 000 x g pendant 3 min et les ressusciter dans un volume final de 500 μL de Mo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation des lames et attache des cellules
	<ol>
<li>Préparer une chambre de fixation cellulaire en empilant une lame de couverture de 18 mm x 18 mm sur une lame de microscope en verre de 3 pouces x 1 pouce x 1 mm, séparée par du ruban adhésif double face(figure S1).</li>
		<li>Rincer la chambre avec une solution de poly-lysine à 0,01% (p / v) en appliquant sur le dessus de la chambre. Inclinez le bord inférieur (la lame de couverture affleurant avec la lame du microscope) sur un essuie-glace de tâche (papier de soie) pour aider à dessiner la solution à travers la chambre(Figure S1). Incuber ensuite à température ambiante pendant 10 min.</li>
		<li>Laver la chambre trois fois avec 40 μL de Mo en utilisant comme décrit à l’étape 2.2.2</li>
		<li>Ajouter 40 μL de la suspension de cellules cailleuses (préparée ci-dessus) au sommet de la chambre et incuber à température ambiante pendant 10 min pour permettre aux cellules de se fixer à la lamelle.</li>
		<li>Rincer délicatement la chambre avec 40 μL de Mo comme au 2.2.3 pour enlever les cellules non attachées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enregistrement et quantification de la rotation cellulaire
	<ol>
<li>Transférer la lame du microscope chargée de cellules attachées à l’étape du microscope.</li>
		<li>À l’aide de la microscopie à contraste de phase et d’un objectif 100x, scannez la population à la recherche de cellules fixées en place et tournant sur un seul axe, c’est-à-dire des rotations lisses sur un point fixe plutôt que de se présenter à un angle dans lequel la cellule se déplace dans et hors de la mise au point(Vidéo 1).</li>
		<li>Utilisez un microscope commercial et une caméra associée. Ouvrez le logiciel associé, assurez-vous que les cellules d’intérêt sont au point et cliquez sur l’acquisition vidéo pour enregistrer la rotation des cellules pendant une minute (à 10 images par seconde ou plus).</li>
		<li>À partir de la lecture vidéo, quantifiez le nombre de rotations complètes par minute et le nombre de fois que la cellule change de direction (fréquence de commutation). REMARQUE: Les vitesses de rotation et la fréquence de commutation peuvent être trop rapides à évaluer à l’œil nu, il est donc recommandé d’utiliser un logiciel vidéo qui offre une lecture lente / fine, ou adopte un système logiciel automatisé pour quantifier les modèles de rotation33. Une alternative serait d’augmenter la viscosité du MB en utilisant de la méthylcellulose (ou un agent similaire) pour aider à ralentir et à résoudre la rotation de bactéries plus rapides ou à compenser lorsque des caméras à faible framerate sont utilisées.</li>
		<li>Répétez l’étape 2.3.2 avec des répétitions biologiques pour compiler une représentation de la population d’intérêt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Préparation d’essaims dans un essai de passage de frontière
REMARQUE: Utilisez cette méthode pour évaluer l’impact d’une mutation ou d’une condition sur la motilité du groupe. L’essaim-agar fait référence à la gélose où le pourcentage est généralement plus élevé que celui de la gélose molle. Dans la gélose molle (0,3 %), les cellules nagent individuellement à l’intérieur de la gélose. Dans la gélose à essaim (0,5 % et plus), les cellules se déplacent en groupe à la surface. Alors que les plaques d’essaim doivent être utilisées comme détaillé ici, les plaques de nage ont une durée de conservation plus longue et peuvent être utilisées pendant plusieurs jours. Notre préférence personnelle est d’utiliser en 1-2 jours.
<ol><li>
Préparation de la gélose à essaim
	<ol>
<li>Ajouter 5 g de gélose Eiken (0,5 % p/v) et 20 g de LB dans une fiole inférieure ronde de 2 L. Ajouter 1 L de ddH2O dans le ballon et mélanger uniformément la suspension à l’aide d’une tige d’agitation et d’une plaque d’agitation magnétique.</li>
		<li>Autoclave pendant 20 min à 121 °C.</li>
		<li>Laisser refroidir avec une agitation douce pour éviter toute bulle d’air en utilisant la tige / plaque comme ci-dessus. À une concentration d’environ 50 °C, ajouter du glucose stérilisé par filtre pour une concentration finale de 0,5 %.</li>
		<li>Verser 25 mL dans des boîtes de Petri stériles (100 mm x 15 mm) et laisser régler à température ambiante pendant au moins 14 h et pas plus de 20 h. Ne pas stocker pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inoculation et incubation de plaques d’essaim
	<ol>
<li>Inoculer 6 μL d’une culture moyenne exponentielle (préparée comme dans 1.2) en les repérant sur le dessus de la gélose.</li>
		<li>Laissez le couvercle éteint pendant 5-10 min et remplacez-le lorsque l’inoculum a séché dans la surface de la gélose.</li>
		<li>Incuber à 30 °C pendant 8 h. Évitez la tentation d’inspecter la progression de l’essaim en enlevant le couvercle, car cela contribuera au séchage de la gélose et altérera l’essaimage. REMARQUE: Le temps d’incubation peut varier selon le phénotype de la souche. Certaines mutations isolées peuvent nuire à la capacité d’essaimage et nécessiteront un pourcentage réduit de gélose ou une période d’incubation plus prolongée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation des plaques d’essai au passage des frontières REMARQUE : Ce test utilise une boîte de Petri modifiée, où une ligne de partage des eaux en plastique (bordure) crée deux chambres, plutôt qu’une(figure 2A). Chaque chambre peut être préparée indépendamment de l’autre, offrant des conditions différentes pour l’essaimage, avant de « connecter » les deux. Selon la conception expérimentale, la première chambre (désignée à gauche) peut être préparée avec de la gélose de nage (0,3 % p/v) ou de la gélose d’essaim (0,5 % p/v) d’où les bactéries peuvent migrer de l’autre côté de la frontière vers la chambre de droite contenant de la gélose d’essaim +/- tout supplément ou défi requis (p. ex. antibiotiques). La migration sur l’une ou l’autre gélose est généralement mesurée/comparée en enregistrant le plus grand diamètre de colonisation bactérienne (bord à bord) à partir du point d’inoculation d’origine.<ol>
<li>Préparer la gélose à la nage décrite à la section 1.1, au besoin.</li>
		<li>Préparer la gélose à essaim comme décrit à la section 3.1.</li>
		<li>Verser environ 30 mL de gélose à essaim (avec la supplémentation souhaitée si nécessaire) dans la chambre droite d’une boîte de Pétri à double compartiment (100 mm x 15 mm), au point où elle est au niveau du diviseur en plastique entre les chambres, mais ne débordant pas dans la gauche(Figure 2B).</li>
		<li>Une fois la gélose durcie, remplissez la chambre gauche avec environ 30 mL de gélose à la nage ou à l’essaim, encore une fois jusqu’au point de contact avec la ligne de partage des eaux en plastique(figure 2C). Avant qu’il ne se mette en place, utilisez une pointe de pipette stérile pour faire glisser doucement la gélose sur la bordure afin de relier les deux côtés avec un pont de gélose d’environ 1 mm de haut qui s’étend sur toute la longueur de la ligne de partage des eaux (Figure 2D).</li>
		<li>Laisser sécher la plaque à température ambiante (3.1). REMARQUE: Une autre méthode de création de pont consiste à laisser sécher la gélose de la chambre gauche, puis à pipetter lentement environ 100 μL de gélose d’essaim fondu le long du diviseur en plastique pour relier les deux chambres (3.4). Inoculer les plaques de la chambre gauche comme indiqué ci-dessus pour nager (1.2.2) ou essaimer (3.2) gélose, avant d’incuber à 30 °C pendant 12-16 h, ou jusqu’à ce que les essaims aient fait suffisamment de progrès sur la chambre droite pour permettre des comparaisons entre les souches d’intérêt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’isolement et la caractérisation des mutations suppresseurs ont contribué avec succès à identifier les composants clés du système de chimiotaxie35,36,37,ainsi que la machinerie motrice elle-même38,39,40. Lors de l’utilisation du protocole 1, il est important d’inclure plusieurs répétitions indépendantes pour assurer l?...

Les bactéries emploient de nombreux appendices pour le mouvement et la dispersion dans leurs niches écologiques1. La motilité induite par flagelles est la plus rapide d’entre elles, favorisant la colonisation de lieux favorables en réponse aux signaux environnementaux, et contribuant de manière significative à la capacité pathogène de certaines espèces2,3. Les bactéries flagellées peuvent nager individuellement dans un liquide en vrac, ou essaimer en tant que collectif sur une surface semi-solide4. Les flagelles extracellulaires se fixent et sont entraînés par des moteurs rotatifs intégrés dans la membrane, qui exploitent la puissance des gradients d’ions pour générer un couple qui provoque une rotation1,2,4,5,6,7,8. Chez E. coli, dont les moteurs fonctionnent à un couple constantde 9, la sortie du moteur peut être classée en termes de vitesse de rotation et de commutation du rotor entre les directions dans le sens inverse des aiguilles d’une montre (CCW) et dans le sens des aiguilles d’une montre (CW). La rotation CCW favorise la formation d’un faisceau flagellaire cohérent qui propulse la cellule vers l’avant (run), tandis qu’un commutateur transitoire dans le sens de rotation (CW) provoque le démontage partiel ou complet du faisceau10,et la cellule réoriente sa direction de nage (chute). E. coli court généralement une seconde et chute pendant un dixième de seconde. La fréquence de commutation du rotor ou « biais de culbute » est contrôlée par le système de signalisation de la chimiotaxie, dans lequel les chimiorécepteurs transmembranaires détectent les signaux chimiques externes et les transmettent via phosphorelay au moteur flagellaire pour prolonger les courses en réponse aux attractifs, ou les supprimer en réponse à des produits chimiques toxiques11,12. La motilité de la natation est analysée dans une gélose molle à 0,3 %.
Pendant l’essaimage, les bactéries naviguent sur une surface semi-solide comme un collectif dense, où des paquets de bactéries coulent dans un mouvement tourbillonnant continu2,13,14,15. Les essaims d’E. coli présentent une physiologie chimiosensorieuse altérée (biais de chute plus faible), des vitesses plus élevées et une tolérance plus élevée aux antimicrobiens sur les cellules nageant dans un liquide en vrac16,17. Les nains varient dans leur déploiement d’une pléthore de stratégies qui facilitent le mouvement, y compris la production de surfactants, l’hyperflagellation et l’allongement cellulaire2. L’essaimage offre aux bactéries un avantage concurrentiel dans les milieux écologiques et cliniques18,19,20. Il existe deux catégories de bactéries essaimantes: les nains tempérés, qui ne peuvent essaimer que sur des milieux solidifiés avec une gélose à 0,5-0,8%, et les nains robustes, qui peuvent naviguer à travers des concentrations de gélose plus élevées21.
Il existe une variété de tests pour interroger la motilité de la natation et sa régulation. Lorsqu’elle est altérée par des mutations ou des conditions environnementales, la motilité elle-même offre une sélection forte pour identifier les mutations suppresseurs de gain de fonction. Ces suppresseurs peuvent être de véritables réducteurs de la mutation d’origine, ou des pseudo-réducteurs, où une deuxième mutation restaure la fonctionnalité. Ces mutants peuvent être identifiés par séquençage du génome entier (WGS). Une solution de rechange à la sélection impartiale des suppresseurs est une stratégie de mutagenèse ciblée biaisée (p. ex. mutagenèse par PCR). Ces méthodologies mettent souvent en lumière la fonction ou la régulation environnementale de l’appareil de motilité. Si l’objectif est d’étudier la fonction motrice, alors la restauration de la motilité de type sauvage telle que mesurée dans la gélose molle n’indique pas nécessairement la restauration de la puissance motrice de type sauvage. L’essai de cellule-attache, dans lequel les cellules sont attachées à une surface de verre par un flagelle simple et la rotation du corps cellulaire est par la suite surveillée, peut être l’essai initial de choix pour évaluer le comportement moteur. Bien que des méthodologies plus sophistiquées soient maintenant disponibles pour surveiller les propriétés du moteur, la configuration de caméras à grande vitesse requise et l’application de progiciels pour l’analyse de mouvement limitent leur utilisation généralisée22,23,24,25. L’essai d’attache cellulaire exige seulement que les flagelles soient ciselés, permettant la fixation des filaments courts à une lame de verre, suivie de l’enregistrement vidéo de la rotation du corps cellulaire. Bien que les vitesses motrices enregistrées soient faibles dans ce test en raison de la charge élevée que le corps cellulaire exerce sur le flagelle, ce test a néanmoins contribué à des informations précieuses sur les réponses chimiotactiques26,27,28,29,et reste un outil d’investigation valide comme discuté ci-dessous.
La motilité de l’essaimage pose un ensemble différent de défis aux chercheurs. La sélection des suppresseurs de gain de fonction ne fonctionne que chez les nains qui produisent des tensioactifs copieux et essaiment facilement13. Les non-producteurs de tensioactifs tels que E. coli sont méqueux en ce qui concerne le choix de la gélose, la composition des milieux et l’humidité de l’environnement2,13,14,21. Une fois les conditions d’essaimage établies, l’essai17 au passage de la frontière est une méthodologie utile pour interroger la capacité d’un essaim à naviguer dans des conditions nouvelles ou difficiles. Bien que les protocoles présentés ci-dessous se rapportent à E. coli,ils peuvent être facilement adaptés pour être épayus chez d’autres espèces.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eiken agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co. Japan</td>
			<td>E-MJ00</td>
			<td>Essential for E. coli swarming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D (+)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent software for microscope used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-285-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX53 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>For soft-agar assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>9908265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89200-944</td>
			<td>For border-crossing assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe - 1 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task/Tissue wipes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Or equivalent single use tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td>Or equivalent microscope camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

La motilité est cruciale pour la survie et le succès de nombreuses espèces bactériennes. De nombreuses méthodologies existent pour exploiter la motilité afin de comprendre les voies de signalisation, d’élucider la fonction et l’assemblage des pièces flagelleuses, et d’examiner et de comprendre les modèles de mouvement. Nous démontrons ici une combinaison de trois de ces méthodologies. La motilité dans la gélose molle est la plus ancienne, offrant une sélection forte pour isoler des mutations de suppresseur de gain-de-fonction dans les contraintes motilité-altérées, où la motilité est reconstituée par une deuxième mutation. La technique d’attache cellulaire, d’abord employée pour démontrer la nature rotative du moteur flagellaire, peut être employée pour évaluer l’impact des effecteurs de signalisation sur la vitesse du moteur et sa capacité à commuter la direction de rotation. L’analyse du « passage de la frontière » est plus récente, où les bactéries nageurs peuvent être amorcées pour passer à se déplacer collectivement comme un essaim. En combinaison, ces protocoles représentent une approche systématique et puissante pour identifier les composants de la machinerie de motilité, et pour caractériser leur rôle dans différentes facettes de la natation et de l’essaimage. Ils peuvent être facilement adaptés pour étudier la motilité chez d’autres espèces bactériennes.

L’isolement des pseudo-rétractants dans une souche d’E. coli dont la motilité est altérée par des niveaux élevés de la molécule de signalisation c-di-GMP, a été détaillé dans des travaux récents de notre laboratoire34. Cette souche (JP1442) a abrité deux mutations : ΔyhjH et ΔycgR. YhjH est la phosphodiestérase la plus active qui dégrade c-di-GMP chez E. coli. L’absence de YhjH conduit à des niveaux élevés de c-di-GMP et à l’inhibiti...

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Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

De nombreuses bactéries utilisent la motilité entraînée par les flagelles pour naviguer dans leur environnement et coloniser un environnement favorable à la fois individuellement et collectivement. Démontré ici est l’utilisation de trois méthodes établies qui exploitent la motilité comme un outil de sélection pour identifier les composants / voies contribuant à la natation et la motilité de l’essaimage.

Étudier la motilité induite par flagelle chez Escherichia coli en appliquant trois techniques établies dans une série

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.4K vues.  The University of Texas at Austin. De nombreuses bactéries utilisent la motilité entraînée par les flagelles pour naviguer dans leur environnement et coloniser un environnement favorable à la fois individuellement et collectivement. Démontré ici est l’utilisation de trois méthodes établies qui exploitent la motilité comme un outil de sélection pour identifier les composants / voies contribuant à la natation et la motilité de l’essaimage.

Vidéo: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un test pour mesurer l&#39;activité des Escherichia coli Inductible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

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Biologie

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Criblage à haut débit activité endoglucanase fongique dans les Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; En utilisant des tableaux synthétiques génétiques

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protocoles pour la mise en œuvre d&#39;un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sur la base du système d&#39;expression cellulaire gratuit TX-TL pour la biologie synthétique

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Détection de Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 par les cellules PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Les avantages multiples de la protéine co-expression dans<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Méthode pour l’étiquetage des transcriptions dans les cellules individuelles Escherichia coli pour Single-molecule Fluorescence In Situ des expériences d’hybridation