Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione gm118085 dei National Institutes of Health e in parte dalla Robert Welch Foundation (sovvenzione F-1811 a R.M.H.).

1. Isolamento dei mutanti soppressori in ceppi carenti di motilità
NOTA: Utilizzare questo metodo come un ampio "catch-all" per identificare la natura generale del difetto di motilità.
<ol><li>Preparazione piastra soft-agar NOTA: Soft-agar, noto anche come motilità o agar da bagno, è un agar a bassa percentuale (~0,2-0,35% w/v), a lungo usato per saggiare chemiotassi31,32.<ol>
<li>Aggiungere 3 g di bacto-agar (0,3% w/v) e 20 g di LB in un pallone inferiore rotondo da 2 L. Aggiungere 1 L di ddH2O (acqua a doppia distillazione) al pallone e mescolare uniformemente la sospensione utilizzando un'asta di agitazione e una piastra di agitazione magnetica.</li>
		<li>Autoclave per 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Lasciare raffreddare con delicata agitazione utilizzando l'asta / piastra come sopra. Quando la temperatura raggiunge circa 50 °C, versare 25 mL in piastre di Petri sterili (100 mm x 15 mm) e lasciare che l'agar fuso si metta con coperchio in posizione per almeno 1 h, da utilizzare entro 16 ore.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della cultura, inoculazione e isolamento dei mutanti soppressori NOTA: E. coli inoculato al centro di mezzi ricchi di nutrienti solidificati con agar morbido consumano nutrienti localmente, creando un gradiente nutritivo che seguono. Mentre si spostano verso l'esterno, compaiono "anelli" definiti (Figura 1A), che sono correlati a specifici chemioatattanti a cui i batteri rispondono. Difetti nel sistema chemiotassi o componenti strutturali del motore flagella possono compromettere le prestazioni in questo saggio. Spesso, i mutanti con un vantaggio di motilità sorgono durante lo screening e possono essere visti emergere da singoli o da più punti lungo la periferia dell'anello, da dove "divampano"(Figura 1C). Si noterà che il bordo più esterno del fronte di nuoto contrasta prontamente con l'agar morbido vergine non colato.<ol>
<li>Coltivare colture notturne del ceppo desiderato carente di motilità in 5 mL di Brodo di Lennox (LB; 10 g/L di triptono, 5 g/L di estratto di lievito e 5 g/L NaCl, Tabella dei Materiali)a 30 °C con scuotimento orizzontale (220 r.p.m.). Il giorno seguente, la sottocultura (diluizione 1:100) in LB fresco, crescendo nelle stesse condizioni fino alla fase esponenziale (OD600 di 0,6).</li>
		<li>Inoculare 6 μL della coltura al centro di una piastra di agar morbido (1.1) utilizzando una pipetta, spingendo la punta sterile caricata nell'agar per espellere delicatamente il contenuto. Trasferimento a 30 °C e incubare (Figura 1B), fino a quando i "brillamenti" di motilità sono evidenti, emanando dal punto di inoculazione o dalla periferia degli anelli di motilità, tipicamente in 24-36 h(Figura 1C). NOTA: Nei saggi di motilità, inoculare un ceppo di tipo selvatico insieme agli isolati mutanti per il confronto. Questo ceppo di tipo selvatico mostrerà i caratteristici anelli chemiotattici concentrici(Figura 1A)e riempirà la piastra entro 8-10 ore.</li>
		<li>Utilizzare un filo-loop sterile per sollevare le cellule dalla regione e dalla striscia "flare" per purificare singole colonie su una piastra di agar duro LB (LB preparata come sopra, solidificata con bacto-agar da 15 g/L).</li>
		<li>Scegli singole colonie dalla piastra di striscia usando un anello di filo sterile e purificale striature per singole colonie per garantire l'isolamento di una colonia "pura" isolata.</li>
	</ol></li>
	<li>Conferma e caratterizzazione dei mutanti soppressori
	<ol>
<li>Verificare che i mutanti soppressori isolati abbiano ripristinato la motilità. Preparare piastre di agar morbido (1.1) e colture per ceppi di interesse (come al punto 1.2.1), compresi i tipi selvatici e il ceppo iniziale "carente di motilità" per il confronto.</li>
		<li>Inoculare le piastre (come in 1.2.2) e incubare a 30 °C per 8-10 h.</li>
		<li>Registrare il diametro dell'anello più esterno (bordo del cerchio) e confrontare per stabilire quale degli isolati ha sostanzialmente ripristinato la motilità. NOTA: Si raccomanda di fotografare le lastre durante tutto il corso del tempo dell'esperimento. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare un dispositivo "secchiello diluce" 30, in cui una fotocamera digitale è montata sopra una sorgente luminosa per una migliore illuminazione per misurare il diametro della colonia di nuoto e distinguerla dall'agar non raggruppato.</li>
		<li>Soggetto isolato in WGS come richiesto, consentendo una sufficiente "copertura della sequenza" per identificare positivamente le mutazioni che hanno ripristinato la funzione di tipo selvaggio.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Quantificare il comportamento motorio della flagella tramite il tethering cellulare
NOTA: utilizzare questo metodo quando il normale comportamento run-tumble (chemiotaxis) sembra essere compromesso.
<ol><li>
Preparazione della cultura e tosatura della flagella
	<ol>
<li>Preparare una cultura di fase esponenziale del ceppo di interesse come descritto al passaggio 1.2.1.</li>
		<li>Pellet 10 mL di cellule per centrifugazione a 2.000 x g per 3 minuti prima di rimescolare in 10 mL di Motiliity Buffer sterilizzato con filtro (MB; Tampone fosfato di potassio da 10 mM [0,0935 M K2HPO4, 0,0065 M KH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], NaCl da 10 mM, 75 mM KCl). NOTA: MB supporta la motilità, ma non supporta la crescita batterica</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2.1.2 altre due volte prima di rimospendere il pellet finale in 1 mL di MB.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare in una siringa da 1 ml e attaccare un ago 23G all'estremità. Assemblare un identico apparato siringa/ago e fissare i due insieme tramite 6 pollici di tubi di polietilene (diametro interno di 0,58 mm) strettamente infilati su ogni punta dell'ago.</li>
		<li>Tosare la flagella (sono fragili e si rompono facilmente) passando delicatamente la sospensione cellulare avanti e indietro da una siringa all'altra 50x, con 1 min di pausa tra ogni 10 passaggi.</li>
		<li>Centrifugare le cellule tranciate a 2.000 x g per 3 minuti e rimombidare in un volume finale di 500 μL di MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione delle diapositive e tethering cellulare
	<ol>
<li>Preparare una camera di fissazione delle celle impilando un coverslip da 18 mm x 18 mm su uno scivolo da microscopio in vetro da 3 pollici x 1 pollice x 1 mm, separato da nastro a doppia parte (Figura S1).</li>
		<li>Sciacquare la camera con soluzione di polilisina 0,01% (w/v) applicandosi sulla parte superiore della camera. Inclinare il bordo inferiore (il coverslip flush con lo scivolo del microscopio) su un tergicristallo (carta velina) per aiutare a disegnare la soluzione attraverso la camera (Figura S1). Quindi incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.</li>
		<li>Lavare la camera tre volte con 40 μL di MB utilizzando come descritto al passaggio 2.2.2</li>
		<li>Aggiungere 40 μL della sospensione cellulare tranciata (preparata sopra) nella parte superiore della camera e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi al coperchio.</li>
		<li>Sciacquare delicatamente la camera con 40 μL di MB come in 2.2.3 per rimuovere le celle non attaccate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Registrazione e quantificazione della rotazione cellulare
	<ol>
<li>Trasferire lo scivolo del microscopio caricato con celle tethered allo stadio del microscopio.</li>
		<li>Utilizzando la microscopia a contrasto di fase e un obiettivo 100x, scansionare la popolazione alla ricerca di cellule fissate in posizione e ruotare su un singolo asse, o cioè rotazioni lisce su un punto fisso piuttosto che presentarsi con un angolo in cui la cella si muove in uscita e fuori fuoco (Video 1).</li>
		<li>Utilizzare un microscopio commerciale e la fotocamera associata. Aprire il software associato, assicurarsi che le celle di interesse siano a fuoco e fare clic sull'acquisizione video per registrare la rotazione delle celle per un minuto (a 10 fotogrammi al secondo o superiore).</li>
		<li>Dalla riproduzione video, quantificare il numero di rotazioni complete al minuto e il numero di volte in cui la cella cambia direzione (frequenza di commutazione). NOTA: Le velocità di rotazione e la frequenza di commutazione possono essere troppo veloci per essere misurate a occhio, quindi si consiglia di utilizzare un software video che offre una riproduzione lenta / fine o adotta un sistema software automatizzato per quantificare i patternrotazionali 33. Un'alternativa sarebbe aumentare la viscosità dell'MB usando la cellulosa metile (o agente simile) per aiutare a rallentare e risolvere la rotazione di batteri più veloci o compensare quando sono in uso telecamere con bassi framerate.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2.3.2 con repliche biologiche per compilare una rappresentazione della popolazione di interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparazione di sciami in un saggio di attraversamento della frontiera
NOTA: Utilizzare questo metodo per valutare l'impatto di una mutazione o condizione sulla motilità di gruppo. Swarm-agar si riferisce all'agar dove la percentuale è tipicamente superiore a quella di soft-agar. Nell'agar morbido (0,3 %), le cellule nuotano individualmente all'interno dell'agar. Nell'agar dello sciame (0,5% e oltre), le cellule si muovono come gruppo sulla superficie. Mentre le piastre dello sciame devono essere utilizzate come descritto in dettaglio qui, le piastre da bagno hanno una durata di conservazione più lunga e possono essere utilizzate per diversi giorni. La nostra preferenza personale è da utilizzare in 1-2 giorni.
<ol><li>
Preparazione dell'agar sciame
	<ol>
<li>Aggiungere 5 g di agar Eiken (0,5% w/v) e 20 g di LB in un pallone inferiore rotondo da 2 L. Aggiungere 1 L di ddH2O al pallone e mescolare uniformemente la sospensione utilizzando un'asta di agitazione e una piastra di agitazione magnetica.</li>
		<li>Autoclave per 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Lasciare raffreddare con delicata agitazione per evitare bolle d'aria utilizzando l'asta / piastra come sopra. Quando si aggiungono circa 50 °C, aggiungere glucosio sterilizzato con filtro per una concentrazione finale dello 0,5 %.</li>
		<li>Versare 25 mL in piastre di Petri sterili (100 mm x 15 mm) e lasciare impostare a temperatura ambiente per almeno 14 ore e non più di 20 ore. Non conservare per un uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inoculazione e incubazione di piastre sciame
	<ol>
<li>Inoculare 6 μL di una coltura medio-esponenziale (preparata come in 1,2) individuando sopra l'agar.</li>
		<li>Lasciare il coperchio spento per 5-10 minuti e sostituire quando l'inoculo si è asciugato nella superficie dell'agar.</li>
		<li>Incubare a 30 °C per 8 ore. Evita la tentazione di ispezionare i progressi dello sciame rimuovendo il coperchio, in quanto ciò contribuirà all'asciugatura dell'agar e compromette lo sciame. NOTA: Il tempo di incubazione può variare a seconda del fenotipo di deformazione. Alcune mutazioni isolate possono ostacolare la capacità di sciame e richiederanno una ridotta percentuale di agar o un periodo di incubazione più prolungato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di targhe di dosaggio transfrontaliere NOTA: Questo saggio utilizza una piastra di Petri modificata, in cui una divisione di plastica (bordo) crea due camere, anziché una (Figura 2A). Ogni camera può essere preparata indipendentemente dall'altra, offrendo condizioni diverse per lo sciame, prima di "collegare" le due. A seconda del design sperimentale, la prima camera (designata a sinistra) può essere preparata con agar da bagno (0,3% w/v) o agar sciame (0,5% w/v) da cui i batteri possono migrare attraverso il confine nella camera destra contenente agar sciame +/- qualsiasi integratore o sfida richiesta (ad esempio, antibiotici). La migrazione su entrambi gli agar viene tipicamente misurata/confrontata registrando il diametro più ampio della colonizzazione batterica (da bordo a bordo) dal punto originale di inoculazione.<ol>
<li>Preparare l'agar da bagno come descritto al punto 1.1, se necessario.</li>
		<li>Preparare l'agar dello sciame come descritto al punto 3.1.</li>
		<li>Versare ~30 mL di agar sciame (con l'integrazione desiderata se necessario) nella camera destra di una piastra di Petri a doppio compartimento (100 mm x 15 mm), al punto in cui è livellata con il divisore di plastica tra le camere, ma non traboccante a sinistra(Figura 2B).</li>
		<li>Dopo che l'agar si è indurito, riempire la camera sinistra con ~ 30 mL di agar da bagno o sciame, di nuovo al punto di contatto con il diviso di plastica(Figura 2C). Prima di impostarlo, utilizzare una punta sterile per trascinare delicatamente l'agar oltre il bordo per collegare i due lati con un ponte di agar alto ~ 1 mm che si estende per l'intera lunghezza della divisione (Figura 2D).</li>
		<li>Lasciare asciugare la piastra a temperatura ambiente (3.1). NOTA: Un metodo alternativo per creare il ponte è consentire all'agar della camera sinistra di asciugarsi e quindi pipettare lentamente ~ 100 μL di agar sciame fuso lungo il divisore di plastica per collegare le due camere (3.4). Inoculare le piastre sulla camera sinistra come sopra dettagliato per nuotare (1.2.2) o sciame (3.2) agar, prima di incubare a 30 °C per 12-16 ore, o fino a quando gli sciami non hanno fatto progressi sufficienti sulla camera destra per consentire confronti tra ceppi di interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'isolamento e la caratterizzazione delle mutazioni soppressori hanno contribuito con successo all'identificazione dei componenti chiave del sistema chemiotassi35,36,37,nonché della macchina motorestessa 38,39,40. Durante l'utilizzo del protocollo 1, è importante includere più repliche indipendenti per garantire l'isolamento di un am...

I batteri impiegano molte appendici per il movimento e la dispersione nelle loro nicchie ecologiche1. La motilità guidata dalla flagella è la più veloce di queste, promuovendo la colonizzazione di località favorevoli in risposta ai segnali ambientali e contribuendo in modo significativo alla capacità patogena di alcunespecie 2,3. I batteri flagellati possono nuotare individualmente in liquido sfuso o sciamare collettivamente su una superficie semi-solida4. La flagella extracellulare si attacca e viene guidata da motori rotanti incorporati nella membrana, che sfruttano la potenza dei gradienti ionici per generare coppia che causala rotazione 1,2,4,5,6,7,8. In E. coli, i cui motori funzionano a una coppia costante 9 , l'uscita del motore può essere classificata in termini di velocità di rotazione e commutazione del rotore tra direzioni antiorario (CCW) e in senso orario (CW). La rotazione CCW promuove la formazione di un fascio flagellare coerente che spinge la cella in avanti (corsa), mentre un interruttore transitorio in direzione rotazionale (CW) fa sì che il fascio si smonti parzialmente o completamente10e la cella riorienti la sua direzione di nuoto (tumble). E. coli in genere corre per un secondo e cade per un decimo di secondo. La frequenza di commutazione del rotore o "tumble bias" è controllata dal sistema di segnalazione chemiotassi, in cui i chemorecettori transmembrana rilevano segnali chimici esterni e li trasmettono tramite fosforelay al motore flagellare per estendere le corse in risposta agli attrattori, o sopprimerle in risposta asostanze chimiche tossiche 11,12. La motilità del nuoto viene saggiata in un agar morbido dello 0,3%.
Durante lo sciame, i batteri navigano su una superficie semi-solida come un collettivo denso, dove branchi di batteri srotoleggiano in un movimento vorticosocontinuo 2,13,14,15. Gli sciami di E. coli mostrano una fisiologia chemiosensoriale alterata (distorsione della caduta inferiore), velocità più elevate e maggiore tolleranza agli antimicrobici sulle cellule che nuotano nel liquido sfuso16,17. Gli sciami variano nella loro implementazione di una pletora di strategie che aiutano il movimento, tra cui la produzione di tensioattivi, l'iperflagellazione e l'allungamento cellulare2. Lo sciame offre ai batteri un vantaggio competitivo sia in contesti ecologici checlinici 18,19,20. Ci sono due categorie di batteri brulicanti: sciami temperati, che possono sciamare solo su supporti solidificati con agar 0,5-0,8%, e sciami robusti, che possono navigare attraverso concentrazioni di agar piùelevate 21.
Esistono una varietà di saggi per interrogare la motilità del nuoto e la sua regolazione. Se compromessa da mutazioni o condizioni ambientali, la motilità stessa offre una forte selezione per identificare le mutazioni soppressori del guadagno di funzione. Questi soppressori possono essere veri revertanti della mutazione originale, o pseudo-revertanti, dove una seconda mutazione ripristina la funzionalità. Tali mutanti possono essere identificati dal sequenziamento dell'intero genoma (WGS). Un'alternativa alla selezione imparziale del soppressore è una strategia di mutagenesi mirata distorta (ad esempio, mutagenesi PCR). Queste metodologie spesso fanno luce sulla funzione o sulla regolazione ambientale dell'apparato di motilità. Se l'obiettivo è quello di studiare la funzione motoria, allora il ripristino della motilità di tipo selvaggio misurata in agar morbido potrebbe non indicare necessariamente il ripristino della produzione motoria di tipo selvaggio. Il saggio di tethering cellulare, in cui le cellule sono attaccate a una superficie di vetro da un singolo flagello e la rotazione del corpo cellulare viene successivamente monitorata, può essere il saggio iniziale di scelta per valutare il comportamento motorio. Sebbene siano ora disponibili metodologie più sofisticate per monitorare le proprietà del motore, la necessaria configurazione e applicazione di pacchetti software per l'analisi del movimento limita il loro usodiffuso 22,23,24,25. Il saggio di tethering cellulare richiede solo che la flagella sia tranciata, consentendo l'attacco dei filamenti corti a uno scivolo di vetro, seguito da una videoregistrazione della rotazione del corpo cellulare. Sebbene le velocità motorie registrate siano basse in questo saggio a causa dell'elevato carico che il corpo cellulare esercita sul flagello, questo saggio ha comunque contribuito a preziose intuizioni sulle risposte chemiotattiche26,27,28,29e rimane un valido strumento investigativo come discusso di seguito.
La motilità brulicante pone una serie diversa di sfide ai ricercatori. La selezione dei soppressori di guadagno di funzione funziona solo in sciami che producono abbondanti tensioattivi e sciamiprontamente 13. I non produttori tensioattivi come E. coli sono esigenti per quanto riguarda la scelta dell'agar, la composizione dei media e l'umiditàdell'ambiente 2,13,14,21. Una volta stabilite le condizioni di sciame, il saggio di attraversamento dellafrontiera 17 è una metodologia utile per interrogare la capacità di uno sciame di navigare in condizioni nuove / difficili. Sebbene i protocolli presentati di seguito riguardino E. coli, possono essere facilmente adattati per l'applicazione in altre specie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eiken agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co. Japan</td>
			<td>E-MJ00</td>
			<td>Essential for E. coli swarming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D (+)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent software for microscope used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-285-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX53 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>For soft-agar assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>9908265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89200-944</td>
			<td>For border-crossing assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe - 1 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task/Tissue wipes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Or equivalent single use tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td>Or equivalent microscope camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

La motilità è fondamentale per la sopravvivenza e il successo di molte specie batteriche. Esistono molte metodologie per sfruttare la motilità per comprendere i percorsi di segnalazione, per chiarire la funzione e l'assemblaggio delle parti flagellari e per esaminare e comprendere i modelli di movimento. Qui dimostriamo una combinazione di tre di queste metodologie. La motilità nell'agar morbido è la più antica, offrendo una forte selezione per isolare le mutazioni soppressori del guadagno di funzione nei ceppi compromessi dalla motilità, dove la motilità viene ripristinata attraverso una seconda mutazione. La tecnica di tethering cellulare, utilizzata per la prima volta per dimostrare la natura rotante del motore flagellare, può essere utilizzata per valutare l'impatto degli effettori di segnalazione sulla velocità del motore e la sua capacità di cambiare direzione rotazionale. Il saggio "border-crossing" è più recente, dove i batteri del nuoto possono essere innescati per passare a muoversi collettivamente come uno sciame. In combinazione, questi protocolli rappresentano un approccio sistematico e potente per identificare i componenti del macchinario di motilità e per caratterizzare il loro ruolo in diverse sfaccettature del nuoto e dello sciame. Possono essere facilmente adattati per studiare la motilità in altre specie batteriche.

L'isolamento degli pseudo-revertanti in un ceppo E. coli la cui motilità è compromessa da alti livelli della molecola di segnalazione c-di-GMP, è stato descritto in recente lavoro del nostro laboratorio34. Questo ceppo (JP1442) ha ospitato due mutazioni: ΔyhjH e ΔycgR. YhjH è la fosfodiesterasi più attiva che degrada il c-di-GMP in E. coli. L'assenza di YhjH porta ad elevati livelli di c-di-GMP e all'inibizione della motilità. YcgR è un effettore c-di-G...

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Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Molti batteri usano la motilità guidata dalla flagella per navigare nel loro ambiente e colonizzare un ambiente favorevole sia individualmente che collettivamente. Qui è dimostrato l'uso di tre metodi consolidati che sfruttano la motilità come strumento di selezione per identificare componenti / percorsi che contribuiscono al nuoto e alla motilità brulicante.

Investigare la motilità guidata dalla Flagella in Escherichia coli applicando tre tecniche consolidate in una serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.4K Views.  The University of Texas at Austin. Molti batteri usano la motilità guidata dalla flagella per navigare nel loro ambiente e colonizzare un ambiente favorevole sia individualmente che collettivamente. Qui è dimostrato l'uso di tre metodi consolidati che sfruttano la motilità come strumento di selezione per identificare componenti / percorsi che contribuiscono al nuoto e alla motilità brulicante.

Video: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un test per misurare l&#39;attività di Escherichia coli Inducibile Lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

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Biologia

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Throughput Screening elevati di attività Endoglucanase fungine in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizzando matrici sintetiche genetiche

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protocolli per l&#39;implementazione di un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sulla base TX-TL cellulare-Free Expression System per la biologia sintetica

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Rilevamento dal vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Celle di PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

I benefici multiforme Protein Co-espressione in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Metodo per l'etichettatura di trascrizioni in cellule individuali Escherichia coli per singola molecola di fluorescenza In Situ gli esperimenti di ibridazione