この研究は、国立衛生研究所助成金GM118085とロバート・ウェルチ財団(R.M.H.にF-1811を付与)によって部分的に支援されました。

1. 運動不足株におけるサプレッサー変異体の分離
注: この方法を広範な「キャッチオール」として使用して、運動性欠陥の一般的な性質を特定してください。
<ol><li>ソフト寒天プレートの準備 注:軟寒天は、運動性または水泳寒天とも呼ばれ、低パーセンテージ寒天(〜0.2-0.35%w/v)であり、長い間気胸31,32をアッセイするために使用される。<ol>
<li>2 Lラウンドボトムフラスコにバクト寒天(0.3%w/v)とLB20gを加えます。フラスコに1LのddH2O(二重蒸留水)を加え、攪拌棒と磁気攪拌板を使用して懸濁液を均等に混合します。</li>
		<li>121 °Cで20分間オートクレーブ。</li>
		<li>上記のようにロッド/プレートを使用して穏やかな攪拌で冷却することができます。温度が約50°Cに達したら、滅菌ペトリ皿(100mm x 15mm)に25mLを注ぎ、溶融寒天を16時間以内に蓋を少なくとも1時間所定の位置にセットします。</li>
	</ol></li>
	<li>培養製剤、接種、およびサプレッサー変異体の単離 注:柔らかい寒天で固まった栄養豊富な培地の中心に接種された 大腸菌 は、栄養素を局所的に消費し、彼らが従う栄養勾配を作り出します。彼らが外側に移動すると、定義された「リング」が現れ(図1A)、これは細菌が反応する特定の化学誘引物質に関連している。このアッセイでは、気化システムまたは構造成分の欠陥が性能を損なう可能性があります。多くの場合、運動性優位を有する変異体はスクリーニング中に生じ、環の周囲に沿った単一または複数の点から出現し、そこから「フレア」アウト(図1C)を見ることができる。一つは、水泳の前線の最も外側の端は、植民地化されていない処女柔らかい寒天と対比容易に気づくでしょう。<ol>
<li>レノックスブロスの5 mLで所望の運動欠乏株の一晩培養を成長させます (LB; 10 g/L トリプトン, 5 g/L酵母エキス, 5 g/L NaCl, 材料表) 水平振幅を有する 30 °Cで (220 r.p..m.).翌日、亜培養(1:100希釈)を新鮮なLBで、同じ条件下で指数相(OD600 0.6)に成長する。</li>
		<li>培養液の6μLをピペットを用いて柔らかい寒天プレート(1.1)の中央に接種し、ロードされた無菌チップを寒天に押し込んで内容物を静かに排出します。30°Cに移し、インキュベート(図1B)、運動性'フレア'が明らかになるまで、運動環の接種点または周辺から発せられる、典型的には24〜36時間(図1C)。 注:運動性アッセイでは、変異体分離物と一緒に野生型株を接種して比較します。この野生型株は特徴的な同心円式化学式の環(図1A)を示し、8-10時間内にプレートを充填します。</li>
		<li>滅菌ワイヤーループを使用して「フレア」領域から細胞を持ち上げ、ストリークして単一コロニーをLB硬寒天プレート(上記のように調製したLB、15 g/Lバクト寒天で固化)に精製します。</li>
		<li>滅菌ワイヤーループを使用してストリークプレートから単一のコロニーを選び、「純粋な」コロニー分離を確実にするために単一のコロニーのためにストリークすることによって再精製します。</li>
	</ol></li>
	<li>サプレッサー変異体の確認と特性評価
	<ol>
<li>分離されたサプレッサー変異体が運動性を回復したことを確認する。軟寒天プレート(1.1)、および野生型と比較のための開始「運動不足」株を含む、関心のある株(1.2.1のように)のための培養を準備します。</li>
		<li>プレート(1.2.2のように)を接種し、30°Cで8〜10時間インキュベートします。</li>
		<li>最も外側のリング(円の縁)の直径を記録し、どの分離株が運動性を実質的に回復させているかを確立するために比較する。 メモ:実験の時間を通してプレートを撮影することをお勧めします。最良の結果を得るためには、デジタルカメラを光源の上に取り付けて、泳ぐコロニーの直径を測定し、非植民地化された寒天と区別する「光のバケツ」装置30を使用する。</li>
		<li>被験者は必要に応じてWGSに隔離し、野生型の機能を回復した突然変異を肯定的に同定するのに十分な「シーケンスカバレッジ」を可能にする。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 細胞テザリングによるフラゲラ運動の挙動を定量化する
注: 通常のランタンブル動作(chemotaxis)が危険にさらされていると思われる場合は、この方法を使用します。
<ol><li>
培養準備とフラゲラせん断
	<ol>
<li>ステップ 1.2.1 で説明したように、対象株の指数位相培養を準備します。</li>
		<li>ペレット 10 mL の細胞は、フィルター滅菌された運動バッファー (MB; 10 mM リン酸カリウムバッファー [0.0935 M K2HPO4,0.0065 M KH2PO4,pH 7.0] , 0.1 mM EDTA [pH 7.0] , 10 mM NaCl, 75 mM KCl. 注:MBは 運動性を サポートしていますが、細菌の増殖をサポートしていません</li>
		<li>ステップ 2.1.2 を 2 回繰り返してから、最終ペレットを 1 mL の MB で再懸濁します。</li>
		<li>細胞懸濁液を1mLのシリンジに移し、23G針を最後に取り付けます。同一の注射器/針装置を組み立て、各針先にしっかりと覆ったポリエチレンチューブ(0.58mmの内径)の6インチを介して2つを一緒に取り付けます。</li>
		<li>1つのシリンジから他の50倍に細胞懸濁液をゆっくりと前後に渡し、10パスごとに1分の休止を行うことによって、フラゲラ(壊れやすく、簡単に壊れる)を剪断します。</li>
		<li>2,000 x g で 3 分間の皮を遠心し、500 μL の最終体積で再中断します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
スライド調製および細胞テザリング
	<ol>
<li>18 mm x 18 mm のカバースリップを 3 インチ x 1 インチ x 1 mm ガラス顕微鏡スライド上に積み重ねて、両面テープで区切ってセル固定チャンバーを準備します (図 S1)。</li>
		<li>チャンバーの上部に塗布することで、0.01%(w/v)ポリリジン溶液でチャンバを洗い流します。下端(顕微鏡スライドでカバースリップをフラッシュ)をタスクワイパー(ティッシュペーパー)に傾け、チャンバー(図S1)を通して溶液を引き出すのに役立ちます。その後、室温で10分間インキュベートします。</li>
		<li>ステップ2.2.2で説明したように使用して、40 μLのMBでチャンバーを3回洗浄します。</li>
		<li>チャンバーの上部に40μLの皮分セル懸濁液(上記を用意)を加え、室温で10分間インキュベートし、細胞をカバースリップに取り付けることができます。</li>
		<li>2.2.3のように40 μLのMBでチャンバーを静かに洗い流し、未接続の細胞を取り除きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞回転記録と定量
	<ol>
<li>つながれた細胞を積んだ顕微鏡のスライドを顕微鏡の段階に移す。</li>
		<li>位相対面顕微鏡と100xの目的を用いて、所定の位置に固定された細胞の母集団をスキャンし、単一軸上で回転する、すなわち、細胞が焦点の出入りする角度で提示するのではなく、固定点で滑らかな回転を行う(ビデオ1)。</li>
		<li>市販の顕微鏡と関連するカメラを使用してください。関連するソフトウェアを開き、対象のセルがフォーカスされていることを確認し、 ビデオ取得 をクリックしてセルの回転を1分間記録します(10フレーム/秒以上)。</li>
		<li>ビデオ再生から、1 分あたりの完全な回転数と、セルの方向 (スイッチング周波数) の変化回数を数値化します。 注:回転速度とスイッチング周波数は目で測定するには速すぎる可能性があるため、低速/細かい再生を提供するビデオソフトウェアを使用するか、自動ソフトウェアシステムを採用して回転パターン33を定量化することをお勧めします。代替手段としては、メチルセルロース(または同様の薬剤)を使用してMBの粘度を上げ、より速い細菌の回転を遅くして解決したり、フレームレートの低いカメラが使用中の場合に補償したりすることです。</li>
		<li>生物学的複製でステップ2.3.2を繰り返し、対象の集団の表現をまとめます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 国境を越えるアッセイにおける群れの準備
注: この方法は、グループ運動性に対する突然変異または条件の影響を評価するために使用します。群寒天とは、一般的に、割合が柔寒天よりも高い寒天を指します。柔らかい寒天(0.3%)では、細胞は寒天の中で個別に泳ぎます。群寒天(0.5%以上)では、細胞は表面上のグループとして移動します。群れプレートはここで詳細に使用する必要がありますが、スイムプレートは貯蔵寿命が長く、数日間使用することができます。私たちの個人的な好みは、1-2日で使用することにあります。
<ol><li>
群寒天の準備
	<ol>
<li>2 Lラウンドボトムフラスコにエイケン寒天5g(0.5%w/v)とLB20gを加えます。フラスコに1LのddH2Oを加え、攪拌棒と磁気攪拌板を使用して懸濁液を均等に混合します。</li>
		<li>121 °Cで20分間オートクレーブ。</li>
		<li>上記のようにロッド/プレートを使用して気泡を避けるために穏やかな攪拌で冷却することができます。約50°Cの場合、フィルター滅菌されたグルコースを加え、最終濃度の0.5%を得ます。</li>
		<li>滅菌ペトリ皿(100ミリメートルx 15ミリメートル)に25 mLを注ぎ、少なくとも14時間と20時間以下の室温で設定することができます。今後の使用のために保管しないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
群板の接種とインキュベーション
	<ol>
<li>寒天の上にスポッティングして、中指数培養物(1.2のように調製)の6μLを接種します。</li>
		<li>蓋を5~10分間は切り、接種物が寒天表面に乾燥したら交換してください。</li>
		<li>30°Cで8時間インキュベートする。これは寒天の乾燥に寄与し、群れを損なうため、蓋を取り除くことによって群れの進行状況を検査する誘惑を避けてください。 注:インキュベーション時間は、歪み表現型によって異なる場合があります。いくつかの孤立した突然変異は、群れの能力を妨げる可能性があり、寒天の減少率またはインキュベーションのより長い期間を必要とします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
国境通過アッセイプレートの準備 注:このアッセイは、プラスチック製の分割(境界)が1つではなく2つのチャンバーを作成する修正されたペトリ皿を利用しています(図2A)。各チャンバーは、2つを「接続」する前に、群れのための異なる条件を提供し、他の独立して準備することができます。実験計画に応じて、第1室(左指定)は、スイム寒天(0.3%w/v)または群寒天(0.5%w/v)のいずれかで調製することができ、そこから細菌は境界を越えて群れの寒天を含む右の部屋に移動することができます+/-必要なサプリメントまたは挑戦(例えば、抗生物質)。いずれの寒天の移動も、通常、接種の元の点から細菌コロニー形成(エッジからエッジ)の最も広い直径を記録することによって測定/比較される。<ol>
<li>必要に応じて、1.1 に記載されているように、スイム寒天を準備します。</li>
		<li>3.1 で説明したように、群れの寒天を準備します。</li>
		<li>〜30 mLの群れ寒天(必要に応じて必要な補充)を、二重コンパートメントペトリ皿(100mm x 15 mm)の右室に注ぎ、チャンバー間のプラスチック仕切りでレベルが高いが、左側にあふれていないところまで(図2B)。</li>
		<li>寒天が固まった後、左室を泳ぐか、または群れの寒天の30mLで満たし、再びプラスチックの分裂と接触するところまで(図2C)。設定する前に、滅菌ピペットチップを使用して、境界線上で寒天をそっとドラッグして、両側を、分割の全長にまたがる約1mmの高さの寒天橋と接続します(図2D)。</li>
		<li>プレートを室温(3.1)で乾燥させます。 注:ブリッジを作成する別の方法は、左チャンバー寒天を乾燥させ、2つのチャンバー(3.4)を橋渡しするためにプラスチック製の仕切りに沿って溶融群寒天のピペット〜100 μLをゆっくりと可能にすることです(3.4)。泳ぐ(1.2.2)または群れ(3.2)寒天のために上記の詳述通り、12-16時間、または群れが右のチャンバー上で十分に進行するまで、左のチャンバーのプレートを接種して、関心のある株の比較を可能にします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

サプレッサー突然変異の分離と特徴付けは、気化システム35、36、37、ならびにモータ機器自体38、39、40の主要成分の同定に成功した。プロトコル1を使用している間、運動性の喪失を補うことができる突然変異の大きなスペクトルの分離を確実にするた?...

細菌は、その生態学的ニッチに移動と分散のための多くの付属物を採用しています1.これらの中で最も速いのが、環境信号に応答して好ましいロケールの植民地化を促進し、いくつかの種2,3の病原性能力に大きく寄与する。バネラ菌は、バルク液体で個別に泳ぐか、半固体表面4の上に集団として群がることができます。細胞外のフラグラは膜に埋め込まれた回転モーターによって取り付けられて駆動され、イオン勾配の力を利用して回転1、2、4、5、6、7、8を引き起こすトルクを発生させる。モーターが一定のトルク9で動く大腸菌では、モーター出力は回転速度と回転子の反時計回り(CCW)方向と時計回り(CW)方向の切り替えの観点から分類することができる。CCW回転は、セルを前方に推進するコヒーレント・フラネラ・バンドルの形成を促進し(CW)、一時的な回転方向スイッチ(CW)を行うと、バンドルは部分的または完全に10個を分解し、細胞は泳方向(タンブル)を再び向きにします。大腸菌は通常1秒間走り、10分の1秒は転倒する。ロータまたは「タンブルバイアス」のスイッチング周波数は、化学運動体信号システムによって制御され、膜貫通化学受容体は外部の化学信号を検出し、リンベレーを介してフラゲラモーターに伝達し、誘引物質に応答してランを延長するか、または有毒化学物質11、12に応答してそれらを抑制する。水泳運動は0.3%柔らかい寒天でアッセイされます。
群れの間、細菌は半固体表面を密な集団として移動し、連続渦巻き運動2、13、14、15の中で細菌のパックが流れる。大腸菌群は、変化した化学感覚生理学(低タンブルバイアス)、より高速、およびバルク液体16、17で泳ぐ細胞に対する抗菌性に対する耐性の高さを示す。スウォーマーは、界面活性剤の生産、ハイパーフラフェレーション、細胞伸長2を含む、運動を助ける多くの戦略の展開において異なる。群れは、細菌に生態学的および臨床的な設定18、19、20の両方で競争上の優位性を提供しています。群れの細菌には、0.5-0.8%寒天で固められた媒体でのみ群がることができる温帯スウォーマーと、より高い寒天濃度21を横切ってナビゲートできる堅牢なスウォーマーの2つのカテゴリーがあります。
水泳の運動性とその規制を尋問するために様々なアッセイが存在します。突然変異や環境条件によって障害を受けた場合、運動性自体は、機能の得るサプレッサー突然変異を同定するための強力な選択を提供する。これらのサプレッサーは、元の突然変異の本物の復帰剤、または第2の突然変異が機能を回復する疑似戻し物である可能性があります。このような変異体は全ゲノムシーケンシング(WGS)によって同定することができる。非バイアスサプレッサー選択の代替は、偏った標的突然変異誘発戦略(例えば、PCR変異生成)である。これらの方法論は、多くの場合、運動装置の機能または環境調節に光を当てる。モータ機能を研究することが目標である場合、軟寒天で測定された野生型運動性の回復は、必ずしも野生型モーター出力の回復を示すものではない。細胞テザリングアッセイは、細胞が単一の旗臼によってガラス表面に結合され、その後、細胞体の回転が監視される、運動行動を評価するための最初のアッセイであり得る。モーターの特性を監視するためにより高度な方法論が利用可能になりましたが、モーション分析のためのソフトウェアパッケージの必要な高速カメラのセットアップと適用は、その広範な使用を制限します22,23,24,25.細胞テザリングアッセイは、フラゲラをせき止めることだけを必要とし、短いフィラメントをガラススライドに取り付けることができ、続いて細胞体の回転をビデオ撮影する。このアッセイでは、細胞体がフラゲラムにかかる負荷が高いため、記録されたモータ速度は低いが、このアッセイは、化学戦術応答26、27、28、29に関する貴重な洞察に寄与しており、以下で説明するように有効な調査ツールのままである。
群れの運動性は、研究者にとって異なる課題をもたらします。機能向上抑制剤の選択は、豊富な界面活性剤を生成し、容易に13を群がって生じるスウォーマーでのみ機能する。大腸菌のような界面活性剤非生産者は、寒天、培地組成及び環境2、13、14、21の湿度の選択に対して潔癖性である。群れの状態が確立されると、国境を越えるアッセイ17は、群れが新しい/過酷な条件をナビゲートする能力を尋問するのに有用な方法論です。以下に示すプロトコルは大腸菌に関連していますが、他の種での適用に容易に適応することができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eiken agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co. Japan</td>
			<td>E-MJ00</td>
			<td>Essential for E. coli swarming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D (+)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent software for microscope used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-285-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX53 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>For soft-agar assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>9908265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89200-944</td>
			<td>For border-crossing assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe - 1 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task/Tissue wipes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Or equivalent single use tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td>Or equivalent microscope camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

運動性は、多くの細菌種の生存と成功に不可欠です。運動性を利用して信号経路を理解し、フラネラ部の機能と組み立てを解明し、運動パターンを調べ、理解するために多くの方法論が存在する。ここでは、これらの方法の3つの組み合わせを示します。柔らかい寒天の運動性は最も古く、運動性障害のある株の機能利得抑制性突然変異を分離するための強力な選択を提供し、運動性は第2の突然変異によって回復する。細胞テザリング技術は、最初に、フラグラーモータの回転性を実証するために使用され、モータ速度および回転方向を切り替える能力に対するシグナルエフェクタの影響を評価するために使用することができる。「国境を越える」アッセイは、水泳細菌が群れとして集団的に移動する準備ができる、より最近のものです。これらのプロトコルは、運動機械の構成要素を特定し、水泳や群れの異なる側面におけるその役割を特徴付けるための体系的かつ強力なアプローチを表しています。それらは他の細菌種の運動性を研究するために容易に合わせることができる。

高レベルのシグナル伝達分子c-di-GMPによって運動性が損なわれる大腸菌株における擬似復帰物質の単離は、我々の研究室34からの最近の研究で詳述された。この株(JP1442)は、ΔyhjHとΔycgRの2つの突然変異を抱えた。YhjHは、大腸菌のc-di-GMPを分解する最も活性なホスホジエステラーゼである。YhjHの不在は、上昇したc-di-GMPレベルと運動性の阻害につなが...

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Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

多くの細菌は、彼らの環境をナビゲートし、個々と集団の両方として有利な環境を植民地化するために、フラゲラ駆動の運動性を使用しています。ここでは、水泳や群れの運動に寄与する成分/経路を特定するための選択ツールとして運動性を利用する3つの確立された方法の使用を実証しています。

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.4K ビュー.  The University of Texas at Austin. 多くの細菌は、彼らの環境をナビゲートし、個々と集団の両方として有利な環境を植民地化するために、フラゲラ駆動の運動性を使用しています。ここでは、水泳や群れの運動に寄与する成分/経路を特定するための選択ツールとして運動性を利用する3つの確立された方法の使用を実証しています。

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An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

の活性を測定するアッセイ大腸菌誘導性リジンDecarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

生物学

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

実装するためのプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em合成生物学のための&gt;に基づくTX-TLの無細胞発現系

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

タンパク質の共発現の多面的メリットで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより、大腸菌におけるフラゲラ駆動運動性の調査