עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק GM118085 ובחלקו על ידי קרן רוברט וולש (מענק F-1811 ל- R.M.H.).

1. בידוד מוטציות מדכאות בזנים חסרי תנועתיות
הערה: השתמש בשיטה זו כ'מלכוד הכל ' רחב כדי לזהות את האופי הכללי של פגם תנועתיות.
<ol><li>הכנת צלחת אגר רכה הערה: רך אגר, המכונה גם תנועתיות - או לשחות אגר, הוא אגר אחוז נמוך (~ 0.2-0.35% w / v), ארוך המשמש כדי assay chemotaxis31,32.<ol>
<li>יש להוסיף 3 גרם של bacto-agar (0.3% w/v) ו-20 גרם של LB לבקבוקון תחתון עגול בנפח 2 ליטר. מוסיפים לבקבוקית 1 ליטר של ddH2O (מים מזוקקים כפולים) ומערבבים באופן שווה את המתלים באמצעות מוט ערבוב וצלחת ערבוב מגנטית.</li>
		<li>כלave אוטומטית במשך 20 דקות ב 121 °C (70 °F).</li>
		<li>אפשר להתקרר עם עצבנות עדינה באמצעות המוט / צלחת כמו לעיל. כאשר הטמפרטורה מגיעה כ 50 °C (50 °F), לשפוך 25 מ"ל לתוך מנות פטרי סטריליות (100 מ"מ x 15 מ"מ), ולאפשר אגר מותך להגדיר עם מכסה במקום לפחות 1 שעה, לשימוש בתוך 16 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת תרבות, חיסון ובידוד של מוטנטים מדכאים הערה: E. coli מחוסן במרכז של מדיה עשירה בחומרים מזינים מוצק עם אגר רך לצרוך חומרים מזינים באופן מקומי, יצירת שיפוע מתזונה שהם עוקבים. כשהם נעים החוצה, מופיעות 'טבעות' מוגדרות (איור 1A), הקשורות לכימותרפיה ספציפית שהחיידקים מגיבים לה. פגמים במערכת chemotaxis או רכיבים מבניים של מנוע flagella יכול לסכן את הביצועים ב- assay זה. לעתים קרובות, מוטנטים עם יתרון תנועתיות מתעוררים במהלך ההקרנה, וניתן לראות אותם מגיחים מנקודות בודדות או ממספר נקודות לאורך הפריפריה של הטבעת, משם הם "מתלקחים" החוצה (איור 1C). ישימו לב שהקצה החיצוני ביותר של חזית השחייה מנוגד בקלות לאגר הבתולה הרכה הלא מכובסת.<ol>
<li>לגדל תרביות לילה של זן תנועתיות-לקוי הרצוי ב 5 מ"ל של מרק לנוקס (LB; 10 גרם / L טריפטון, 5 גרם / L תמצית שמרים, ו 5 g / L NaCl, שולחן חומרים) ב 30 °C עם רעד אופקי (220 r.p.m.). למחרת, תת-תרבות (1:100 דילול) ב- LB טרי, גדל באותם תנאים לשלב מעריכי (OD600 של 0.6).</li>
		<li>לחסן 6 μL של התרבות למרכז צלחת אגר רך (1.1) באמצעות pipette, דוחף את הקצה סטרילי טעון לתוך אגר לגרש בעדינות את התוכן. מעבירים ל-30 מעלות צלזיוס ודגרה (איור 1B),עד ל ניכרים "התלקחויות" תנועתיות, הנובעות מנקודת החיסון או מהפריפריה של טבעות תנועתיות, בדרך כלל ב-24-36 שעות(איור 1C). הערה: בבוחות תנועתיות, לחסן זן מסוג פראי לצד המבודדים המוטנטיים לשם השוואה. זן בר זה יציג את הטבעות הכימיות הקונצנטריות האופייניות (איור 1A) וימלא את הצלחת בתוך 8-10 שעות.</li>
		<li>השתמש בלולאת תיל סטרילית כדי להרים את התאים מאזור 'התלקחות' ולפגוע כדי לטהר מושבות בודדות על צלחת אגר קשה LB (LB מוכן כנ"ל, מגובש עם 15 גרם / L bacto-אגר).</li>
		<li>בחרו מושבות בודדות מצלחת הפס באמצעות לולאת תיל סטרילית וטוהרו מחדש על ידי פסים למושבות בודדות כדי להבטיח בידוד של מבודד מושבה 'טהורה'.</li>
	</ol></li>
	<li>אישור, ואפיון של מוטציות מדכאות
	<ol>
<li>אשר שהמוטנטים המבודדים החזירו את תנועתיותם. הכן לוחות אגר רכים (1.1), ותרבויות לזנים מעניינים (כמו ב-1.2.1), כולל סוג פראי ומתח 'חסר תנועתיות' התחלתי להשוואה.</li>
		<li>לחסן את הצלחות (כמו 1.2.2) ודגור ב 30 °C (8-10 שעות.</li>
		<li>להקליט את הקוטר של הטבעת החיצונית ביותר (קצה המעגל) ולהשוות כדי לקבוע מי של מבודדים יש תנועתיות משוחזרת באופן משמעותי. הערה: מומלץ לצלם צלחות לאורך כל מהלך הניסוי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בהתקן "דלי של אור"30, שבו מצלמה דיגיטלית מותקנת מעל מקור אור להארה טובה יותר כדי למדוד את הקוטר של מושבת השחייה ולהבדיל אותו אגר לא קוטבי.</li>
		<li>הנבדק אומת מבודד ל- WGS כנדרש, ומאפשר 'כיסוי רצף' מספיק כדי לזהות באופן חיובי את המוטציות ששיקמו פונקציה מסוג בר.</li>
	</ol></li>
</ol>2. כימות התנהגות מוטורית פלאגלה באמצעות קשירת תאים
הערה: השתמש בשיטה זו כאשר נראה שהתנהגות רגילה של ריצה-נופלת (chemotaxis) נפגעת.
<ol><li>
הכנת תרבות וגזלת דגלה
	<ol>
<li>הכן תרבות שלב מעריכית של זן העניין כמתואר בשלב 1.2.1.</li>
		<li>פלט 10 מ"ל של תאים לפי צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 3 דקות לפני הוצאה חוזרת ב 10 מ"ל של מאגר תנועתיות מעוקר מסנן (MB; 10 mM אשלגן פוספט חוצץ [0.0935 M K2HPO4, 0.0065 M KH2PO4, pH 7.0], 0.1 mM EDTA [pH 7.0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). הערה: MB תומך תנועתיות, אבל אינו תומך בצמיחה חיידקית</li>
		<li>חזור על שלב 2.1.2 פעמיים נוספות לפני ususpending הכדור הסופי ב 1 מ"ל של MB.</li>
		<li>מעבירים את ההשעיה של התא למזרק של 1 מ"ל ומצמידים מחט 23G לסוף. להרכיב מזרק זהה / מחט מנגנון ולחבר את השניים יחד באמצעות 6 אינץ 'של צינורות פוליאתילן (קוטר פנימי של 0.58 מ"מ) נדן בחוזקה על כל קצה מחט.</li>
		<li>גנו את הדגלה (הם שבירים ונשברים בקלות) על ידי העברת מתלה התא בעדינות הלוך ושוב ממזרק אחד לשני 50x, עם הפסקות של דקה אחת בין כל 10 מעברים.</li>
		<li>צנטריפוגה התאים הגוזלים ב 2,000 x g במשך 3 דקות resuspend בנפח סופי של 500 μL של MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת שקופיות וקשירת תאים
	<ol>
<li>הכן תא קיבוע תאים על-ידי ערימת כיסוי 18 מ"מ x 18 מ"מ מעל שקופית מיקרוסקופ זכוכית בגודל 3 אינץ' x 1 אינץ' x 1 מ"מ, המופרדת באמצעות סרט דו-צדדי(איור S1).</li>
		<li>לשטוף את התא עם 0.01% (w/v) פתרון פולי-ליסין על ידי החלה על החלק העליון של התא. הטה את הקצה התחתון (כיסוי ריק עם שקופית המיקרוסקופ) על מגב משימות (נייר טישו) כדי לעזור לצייר פתרון דרך התא(איור S1). לאחר מכן לדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
		<li>לשטוף את התא שלוש פעמים עם 40 μL של MB באמצעות כמתואר בשלב 2.2.2</li>
		<li>הוסף 40 μL של השעיית תא גיהון (מוכן לעיל) לחלק העליון של התא ודגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים להתחבר כיסוי.</li>
		<li>יש לשטוף בעדינות את התא עם 40 μL של MB כמו ב 2.2.3 כדי להסיר תאים לא מחוברים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הקלטה וכימות סיבוב תאים
	<ol>
<li>העבר את שקופית המיקרוסקופ העמוסה בתאים קשורים לשלב המיקרוסקופ.</li>
		<li>באמצעות מיקרוסקופיה משולבת פאזה ומטרה 100x, לסרוק את האוכלוסייה עבור תאים קבועים במקום, ומסתובב על ציר אחד, כלומר, סיבובים חלקים על נקודה קבועה במקום להציג בזווית שבה התא נע פנימה והחוצה של המוקד (וידאו 1).</li>
		<li>השתמש במיקרוסקופ מסחרי ובמצלמה משויכת. פתח את התוכנה המשויכת, ודא שתאי העניין נמצאים במוקד ולחץ על רכישת וידאו כדי להקליט את סיבוב התא למשך דקה אחת (ב- 10 פריימים לשנייה ומעלה).</li>
		<li>מהפעלת וידאו, לכמת את מספר הסיבובים המלאים לדקה ואת מספר הפעמים שהתא משנה כיוון (תדירות מיתוג). הערה: מהירויות סיבוב ותדירות מיתוג עשויות להיות מהירות מדי לאמוד אחר עין ולכן מומלץ להשתמש בתוכנת וידאו המציעה הפעלה איטית / עדינה, או מאמצת מערכת תוכנה אוטומטית לכימות דפוסי סיבוב33. חלופה תהיה להגדיל את הצמיגות של MB באמצעות תאית מתיל (או סוכן דומה) כדי לעזור להאט ולפתור את הסיבוב של חיידקים מהירים יותר או לפצות כאשר מצלמות עם קצבי מסגרת נמוכים נמצאים בשימוש.</li>
		<li>חזור על שלב 2.3.2 עם שכפולים ביולוגיים כדי להרכיב ייצוג של אוכלוסיית העניין.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הכנת נחילים בבדיחת מעבר גבול
הערה: השתמש בשיטה זו להערכת ההשפעה של מוטציה או תנאי על תנועתיות קבוצתית. נחיל אגר מתייחס אגר שבו האחוז הוא בדרך כלל גבוה יותר מזה של אגר רך. באגר רך (0.3 %), תאים שוחים בנפרד בתוך אגר. באגר נחיל (0.5% ומעלה), התאים נעים כקבוצה על פני השטח. בעוד לוחות נחיל חייב לשמש כמפורט כאן, צלחות שחייה יש חיי מדף ארוכים יותר, והוא עשוי לשמש במשך כמה ימים. ההעדפה האישית שלנו היא להשתמש בעוד 1-2 ימים.
<ol><li>
הכנת אגר נחיל
	<ol>
<li>הוסף 5 גרם של אגר אייקן (0.5% w/v) ו-20 גרם של LB לבקבוקון תחתון עגול של 2 ליטר. מוסיפים 1 ליטר של ddH2O לבקבוק ומערבבים באופן שווה את המתלים באמצעות מוט ערבוב וצלחת ערבוב מגנטית.</li>
		<li>כלave אוטומטית במשך 20 דקות ב 121 °C (70 °F).</li>
		<li>אפשר להתקרר עם עצבנות עדינה כדי למנוע בועות אוויר באמצעות המוט / צלחת כמו לעיל. כאשר כ 50 °C (50 °F), להוסיף גלוקוז מעוקר מסנן לריכוז סופי של 0.5 %.</li>
		<li>יוצקים 25 מ"ל לתוך מנות פטרי סטריליות (100 מ"מ x 15 מ"מ) ומאפשרים להגדיר בטמפרטורת החדר לפחות 14 שעות ולא יותר מ 20 שעות. אין לאחסן לשימוש עתידי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
חיסון ודגורה של לוחות נחיל
	<ol>
<li>לחסן 6 μL של תרבות מעריכית בינונית (מוכן כמו 1.2) על ידי תצפית על גבי אגר.</li>
		<li>משאירים את המכסה למשך 5-10 דקות ומחליפים כאשר האינוקולום התייבש לתוך משטח אגר.</li>
		<li>דגירה ב 30 °C (50 °F) במשך 8 שעות. הימנע הפיתוי לבדוק את התקדמות הנחיל על ידי הסרת המכסה, שכן זה יתרום לייבוש של אגר ולפגום נחילים. הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם פנוטיפ המתח. מוטציות מבודדות מסוימות עלולות לפגוע ביכולת הנחיל ויחייבו אחוז מופחת של אגר או תקופה ממושכת יותר של דגירה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת לוחות אסי של מעבר גבול הערה: בדיקת ישבן זו משתמשת בצלחת פטרי מותאמת, שבה חלוקת פלסטיק (גבול) יוצרת שני תאים, ולא אחד(איור 2A). כל תא יכול להיות מוכן ללא תלות בשני, ומציע תנאים שונים לנחיל, לפני "חיבור" בין השניים. בהתאם לתכנון ניסיוני, ניתן להכין את התא הראשון (המיועד משמאל) עם אגר שחייה (0.3% w/v) או אגר נחיל (0.5% w/v) שממנו החיידקים יכולים לנדוד מעבר לגבול לתא הימני המכיל אגר נחיל +/- כל תוספת או אתגר נדרשים (למשל, אנטיביוטיקה). נדידה על כל אגר נמדדת /בהשוואה בדרך כלל על ידי רישום הקוטר הרחב ביותר של קולוניזציה חיידקית (מקצה לקצה) מנקודת החיסון המקורית.<ol>
<li>הכן אגר שחייה כמתואר ב-1.1 במידת הצורך.</li>
		<li>הכן אגר נחיל כמתואר ב 3.1.</li>
		<li>יוצקים ~ 30 מ"ל של אגר נחיל (עם תוספי הרצוי במידת הצורך) לתא הימני של צלחת פטרי כפולה (100 מ"מ x 15 מ"מ), עד לנקודה שבה הוא מאוזן עם מחיצת הפלסטיק בין התאים, אך לא עולה על גדותיו לשמאל(איור 2B).</li>
		<li>לאחר שהאגאר התקשה, מלאו את התא השמאלי ב-30 מ"ל של שחייה או אגר נחיל, שוב עד כדי מגע עם חלוקת הפלסטיק(איור 2C). לפני שהוא קובע, השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי לגרור בעדינות את הגר מעבר לגבול כדי לחבר את שני הצדדים עם גשר אגר בגובה ~ 1 מ"מ המשתרע על כל אורך החלוקה (איור 2D).</li>
		<li>אפשר לצלחת להתייבש בטמפרטורת החדר (3.1). הערה: שיטה חלופית ליצירת גשר היא לאפשר אגר התא השמאלי להתייבש ולאחר מכן לאט pipette ~ 100 μL של אגר נחיל מותך לאורך מחיצת הפלסטיק לגשר בין שני התאים (3.4). לחסן את הצלחות על התא השמאלי כמפורט לעיל לשחייה (1.2.2) או נחיל (3.2) אגר, לפני הדגירה ב 30 °C (12-16 שעות), או עד נחילים עשו התקדמות מספקת מעל התא הימני כדי לאפשר השוואות בין זנים של עניין.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הבידוד והאפיון של מוטציות מדכאות תרמו בהצלחה לזיהוי מרכיבים מרכזיים של מערכת הכימוטקסי35,36,37, כמו גם את המכונות המוטוריות עצמן38,39,40. בעת השימוש בפרוטוקול 1, חשוב לכלול שכפולים עצמאיים מרו?...

חיידקים מעסיקים נספחים רבים לתנועה ופיזור בנישות האקולוגיות שלהם1. תנועתיות המונעת על ידי פלאגלה היא המהירה שבהן, מקדמת קולוניזציה של אזורים נוחים בתגובה לאותות סביבתיים, ותורמת באופן משמעותי ליכולת הפתוגנית של מינים מסוימים2,3. חיידקים מוכים יכולים לשחות בנפרד בנוזל בתפזורת, או נוהרים כקולקטיב על פני משטח חצי מוצק4. פלאגלה חוץ-תאית מתחברת ומונעת על ידי מנועים סיבוביים המוטמעים בממברנה, אשר רותמים את העוצמה של שיפועי יונים כדי ליצור מומנט שגורם לסיבוב1,2,4,5,6,7,8. ב- E. coli, שהמנועים שלו פועלים על מומנט קבוע9, ניתן לסווג את פלט המנוע במונחים של מהירות סיבובית ומיתוג הרוטור בין כיווני נגד כיוון השעון (CCW) ובכיוון השעון (CW). סיבוב CCW מקדם היווצרות של חבילת flagellar קוהרנטית המניעה את התא קדימה (ריצה), בעוד מתג ארעי בכיוון הסיבוב (CW) גורם לחבילה להתפרק באופן חלקי או מלא10, והתא כדי לכוון מחדש את כיוון השחייה שלו (ליפול). אי קולי בדרך כלל לרוץ לשנייה ליפול במשך עשירית שנייה. תדירות המיתוג של הרוטור או 'הטיית הנפילה' נשלטת על ידי מערכת איתות chemotaxis, שבה chemoreceptors transmembrane לזהות אותות כימיים חיצוניים ולהעביר אותם באמצעות זרחן למנוע flagellar להאריך ריצות בתגובה למשוך, או לדכא אותם בתגובה כימיקלים רעילים11,12. תנועתיות השחייה נמדת ב-0.3% אגר רך.
במהלך ההמולה, חיידקים מנווטים על משטח מוצק למחצה כקולקטיב צפוף, שבו חבילות של חיידקים זורמות בתנועה מסתחררת רציפה2,13,14,15. נחילי E. coli מציגים פיזיולוגיה כימוסנסורית שונה (הטיית טבילה נמוכה יותר), מהירויות גבוהות יותר, וסובלנות גבוהה יותר לאנטי מיקרוביאלים מעל תאים שוחים בנוזל בתפזורת16,17. נחילים משתנים בפריסתם של שפע של אסטרטגיות המסייעות לתנועה, כולל ייצור פעילי שטח, היפרפלציה, והארכות תאים2. נחיל מציע חיידקים יתרון תחרותי הן מבחינה אקולוגית והן בסביבה קלינית18,19,20. ישנן שתי קטגוריות של חיידקים נוהרים: נחילים ממוזגים, אשר יכול לנחיל רק על מדיה מוצק עם 0.5-0.8% אגר, ונחילים חזקים, אשר יכול לנווט על פני ריכוזי אגר גבוהיםיותר 21.
קיימים מגוון של חקירות כדי לחקור תנועתיות שחייה והרגולציה שלה. כאשר הוא נפגע ממוטציות או מתנאים סביבתיים, תנועתיות עצמה מציעה מבחר חזק לזיהוי מוטציות מדכאות רווח-של-פונקציה. מדכאים אלה יכולים להיות חוזרים מקוריים של המוטציה המקורית, או חוזרים מדומים, שבהם מוטציה שנייה משחזרת את הפונקציונליות. מוטציות כאלה ניתן לזהות על ידי ריצוף גנום שלם (WGS). חלופה לבחירת מדכאים משוחדים היא אסטרטגיית מוטה של מוטגנסיס ממוקדת (למשל, מוטאגנסיס PCR). מתודולוגיות אלה שופכות לעתים קרובות אור על התפקוד או הרגולציה הסביבתית של מנגנון תנועתיות. אם המטרה היא ללמוד פונקציה מוטורית, אז שיקום תנועתיות מסוג פראי כפי שנמדד אגר רך לא בהכרח להצביע על שיקום של תפוקת מנוע מסוג בר. הבדיקה הקשורה לתא, שבה תאים מחוברים למשטח זכוכית על ידי flagellum יחיד וסיבוב של גוף התא מנוטר לאחר מכן, יכול להיות הבדיקה הראשונית של בחירה להערכת התנהגות מוטורית. למרות מתודולוגיות מתוחכמות יותר זמינים כעת כדי לפקח על תכונות מנוע, הגדרת המצלמה במהירות גבוהה הנדרשת ויישום של חבילות תוכנה לניתוח תנועה להגביל את השימוש הנרחב שלהם22,23,24,25. ההסרה הקשורה לתא דורשת רק להטות את הדגלה, ומאפשרת חיבור של הסיבים הקצרים למגלשת זכוכית, ואחריה צילום סיבוב גוף התא. למרות שמהירויות המנוע המתועדות נמוכות במיון זה בגלל העומס הגבוה שגוף התא מפעיל על הפלסטלום, ניסיון זה בכל זאת תרם לתובנות יקרות ערך על תגובות כימיות26,27,28,29, ונשאר כלי חקירה תקף כפי שנדון להלן.
תנועתיות נוהרת מציבה בפני החוקרים מערכת אתגרים שונה. מבחר מדכאי ההשגה עובד רק בנחילים המייצרים פעילי שטח בשפע ונוהרים בקלות13. פעילי שטח שאינם מפיקים כגון E. coli הם בררניים ביחס לבחירה של אגר, הרכב מדיה ולחות שלהסביבה 2,13,14,21. לאחר קביעת תנאי ההמולה, חוצה הגבול17 הוא מתודולוגיה שימושית לחקור את היכולת של נחיל לנווט בתנאים חדשים / קשים. למרות הפרוטוקולים המוצגים להלן מתייחסים E. coli, הם יכולים להיות מותאמים בקלות ליישום במינים אחרים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eiken agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co. Japan</td>
			<td>E-MJ00</td>
			<td>Essential for E. coli swarming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D (+)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent software for microscope used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-285-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX53 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>For soft-agar assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>9908265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89200-944</td>
			<td>For border-crossing assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe - 1 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task/Tissue wipes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Or equivalent single use tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td>Or equivalent microscope camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

תנועתיות חיונית להישרדותם ולהצלחתם של מינים חיידקיים רבים. מתודולוגיות רבות קיימות כדי לנצל תנועתיות כדי להבין נתיבי איתות, כדי לבהיר את הפונקציה וההרכבה של חלקים flagellar, ולבחון ולהבין דפוסי תנועה. כאן אנו מדגימים שילוב של שלוש מתודולוגיות אלה. תנועתיות בגר רך היא העתיקה ביותר, המציעה מבחר חזק לבידוד מוטציות מדכאות רווח-של-תפקוד בזנים לקויי תנועתיות, שם תנועתיות משוחזרת באמצעות מוטציה שנייה. טכניקת קשירת התא, המשמשת תחילה כדי להדגים את האופי הסיבובי של המנוע flagellar, ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשפעה של משפיעי איתות על מהירות המנוע ואת יכולתה לעבור כיוון סיבובי. בדיקת "מעבר הגבול" היא עדכנית יותר, שבה חיידקי שחייה יכולים להיות מוכנים לעבור לנוע באופן קולקטיבי כנחיל. בשילוב, פרוטוקולים אלה מייצגים גישה שיטתית ועוצמתית לזיהוי רכיבים של מכונות תנועתיות, ולאפיון תפקידם בהיבטים שונים של שחייה ונחילה. הם יכולים להיות מותאמים בקלות כדי ללמוד תנועתיות במינים חיידקיים אחרים.

הבידוד של פסאודו-חוזרים בזן E. coli אשר תנועתיות נפגעת על ידי רמות גבוהות של מולקולת האיתות c-di-GMP, פורט בעבודה האחרונה מהמעבדה שלנו34. זן זה (JP1442) טפח שתי מוטציות: ΔyhjH ו ΔycgR. YhjH הוא הזרחן הפעיל ביותר שמשפיל את C-di-GMP ב- E. coli. היעדר YhjH מוביל רמות גבוהות c-di-GMP ועיכוב תנוע...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series at JoVE.com

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

חיידקים רבים משתמשים בתנועתיות המונעת על ידי פלאגלה כדי לנווט בסביבתם וליישב סביבה נוחה הן בנפרד והן כקולקטיב. הוכח כאן הוא השימוש בשלוש שיטות מבוססות המנצלות תנועתיות ככלי בחירה לזיהוי רכיבים / מסלולים התורמים לשחייה ותנועתיות נחיל.

חקירת תנועתיות מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.5K Views.  The University of Texas at Austin. חיידקים רבים משתמשים בתנועתיות המונעת על ידי פלאגלה כדי לנווט בסביבתם וליישב סביבה נוחה הן בנפרד והן כקולקטיב. הוכח כאן הוא השימוש בשלוש שיטות מבוססות המנצלות תנועתיות ככלי בחירה לזיהוי רכיבים / מסלולים התורמים לשחייה ותנועתיות נחיל.

Video: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; ו<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.