이 작품은 건강 보조금 GM118085의 국가 학회에 의해 지원되었고 부분적으로 로버트 웰치 재단 (R.M.H.에 F-1811을 부여)에 의해 지원되었습니다.

1. 운동성 결핍 균주에서 억제제 돌연변이의 격리
참고: 이 방법을 광범위한 '캐치-올'로 사용하여 운동성 결함의 일반적인 특성을 식별합니다.
<ol><li>소프트 마고 플레이트 준비 참고: 연골 또는 수영 용으로도 불리는 소프트 에이저는 화학 요법31,32를분석하는 데 오랫동안 사용되었던 낮은 비율의 한천(~0.2-0.35%w/v)입니다.<ol>
<li>바토-한천 3g(0.3% w/v)과 LB 20g을 2L 라운드 하단 플라스크에 넣습니다. 플라스크에 ddH2O(이중 증류수) L 1L을 넣고 교반봉과 자기 교반 플레이트를 사용하여 서스펜션을 균일하게 혼합합니다.</li>
		<li>121 °C에서 20 분 동안 오토 클레이브.</li>
		<li>위와 같이 막대/접시를 사용하여 부드러운 교반으로 식힙니다. 온도가 약 50°C에 도달하면 멸균 페트리 접시(100mm x 15mm)에 25mL을 붓고, 16시간 이내에 사용하기 위해 용융 된 한천을 뚜껑으로 1 시간 이상 제자리에 놓아 두도록 하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>억제제 돌연변이의 문화 준비, 접종 및 격리 참고: 부드러운 천으로 고화된 영양이 풍부한 매체의 중심에 접종된 대장균은 현지에서 영양소를 섭취하여 영양소그라데이션을 생성합니다. 그들은 바깥쪽으로 이동함에 따라, 정의된 '반지'가 나타나며(그림1A)는박테리아가 반응하는 특정 화학 요법과 관련이 있습니다. 치셀라 모터의 화학 요법 시스템 또는 구조 성분의 결함은 이 분석에서 성능을 저하시킬 수 있습니다. 종종, 운동성 이점을 가진 돌연변이는 스크리닝 중에 발생하며, 링 주변을 따라 단일 또는 여러 지점에서 나오는 것을 볼 수 있으며, 어디에서 '플레어'아웃(그림1C). 하나는 수영 전면의 가장 바깥쪽 가장자리가 식민지화되지 않은 처녀 부드러운 한천과 쉽게 대조되는 것을 알 수 있습니다.<ol>
<li>레녹스 브로스(LB; 10g/L 트라이프톤, 5g/L 효모 추출물, 5g/L, 재료테이블)의5mL에서 원하는 운동성 결핍 균주의 하룻밤 배양을 수평 흔들림(220 r.p.m)으로 성장시다. 다음 날, 신선한 LB의 하위 배양(1:100 희석)은 기하급수적 단계(OD600/0.6)와 같은 조건에서 성장한다.</li>
		<li>배양물의 6 μL을 파이펫을 사용하여 부드러운 천판(1.1)의 중심으로 접종하여 적재된 멸균 팁을 한천으로 밀어 넣고 내용물들을 부드럽게 추방합니다. 30°C로 이송하고 인큐베이션(도1B)으로옮겨가며, 운동성 '플레어'가 분명해질 때까지, 전형적으로 24-36h(도1C)에서접종지점 또는 운동성 고리의 주변에서 발산된다. 참고: 운동성 애서에서, 비교를 위해 돌연변이 분리와 함께 야생 형 변형을 접종하십시오. 이 야생형 균주는 특징적인 동심형 화학고리(도1A)를나타내고 8-10h 이내에 플레이트를 채웁니다.</li>
		<li>멸균 와이어 루프를 사용하여 '플레어' 영역에서 세포를 들어 올리고 줄무늬를 사용하여 단일 콜로니를 LB 하드 한천 플레이트에 정화합니다(위와 같이 준비된 LB, 15 g/L bacto-agar로 고화).</li>
		<li>멸균 와이어 루프를 사용하여 줄무늬 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 단일 콜로니를 줄이면 다시 정화하여 '순수한' 식민지 분리를 보장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>억제제 돌연변이의 확인 및 특성화
	<ol>
<li>격리된 억제제 돌연변이가 운동성을 복원한지 확인합니다. 연한 천식판(1.1)과 관심있는 균주에 대한 문화(1.2.1)를 준비하여 야생형및 비교를 위한 시작 '운동성 결핍' 균주를 포함한다.</li>
		<li>플레이트(1.2.2에서와 같이)를 접종하고 8-10h에 대해 30°C에서 배양한다.</li>
		<li>가장 바깥쪽 링(원의 모서리)의 직경을 기록하고 어느 격리된 분리가 실질적으로 변성을 회복했는지 를 설정하는 것과 비교합니다. 참고: 실험 시간 과정 내내 플레이트를 촬영하는 것이 좋습니다. 최상의 결과를 얻으려면 디지털 카메라가 광원 위에 장착되어 수영 식민지의 직경을 측정하고 콜로니화되지 않은 천과 구별하는 "빛의 양동이"장치(30)를사용하십시오.</li>
		<li>피험자는 필요에 따라 WGS로 격리되어 야생 형 기능을 복원한 돌연변이를 긍정적으로 식별하기에 충분한 '서열 범위'를 허용합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 셀 테더링을 통한 플래그텔라 모터 거동 정량화
참고: 정상적인 텀블 동작(화학 요법)이 손상된 것처럼 보이는 경우 이 메서드를 사용합니다.
<ol><li>
문화 준비 및 플래그젤라 전단
	<ol>
<li>1.2.1 단계에서 설명된 바와 같이 관심있는 변형의 기하급수적 위상 배양을 준비한다.</li>
		<li>10mL의 필터 멸균 운동완충(MB)에서 재중단하기 전에 3분 동안 2,000 x g에서 원심분리에 의한 세포의 펠릿 10mL; 10mM 칼륨 인산염 버퍼 [0.0935 M K2HPO4,0.0065 M KH2PO4,pH 7.0], 0.1 mM EDTA [pH 7.0], 10mM NaCl, 75mM KCl). 참고 : MB는 운동성을지원하지만 세균 성장을 지원하지 않습니다</li>
		<li>MB의 1mL에서 최종 펠릿을 다시 중단하기 전에 2.1.2 단계를 두 번 더 반복하십시오.</li>
		<li>셀 서스펜션을 1mL 주사기로 옮기고 23G 바늘을 끝까지 부착한다. 동일한 주사기/바늘 장치를 조립하고 각 바늘 끝에 단단히 피포링 된 6 인치 폴리에틸렌 튜브 (내경 0.58mm)를 통해 두 가지를 함께 부착하십시오.</li>
		<li>10번의 패스마다 1분 동안 일시 정지하여 셀 서스펜션을 한 주사기에서 다른 50x로 부드럽게 전달하여 플래그젤라(쉽게 깨지기 쉽고 쉽게 파손)를 전단합니다.</li>
		<li>3 분 동안 2,000 x g에서 전경 세포를 원심 분리하고 MB의 500 μL의 최종 부피로 다시 중단합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
슬라이드 준비 및 셀 테더링
	<ol>
<li>3인치 x 1인치 x 1mm 유리 현미경 슬라이드 위에 18mm x 18mm 커버슬립을 적층하여 양면테이프(도면 S1)로분리하여 셀 고정 챔버를 준비합니다.</li>
		<li>챔버의 상단에 적용하여 0.01 % (w / v) 폴리 리신 용액으로 챔버를 플러시하십시오. 바닥 가장자리(현미경 슬라이드로 커버슬립 플러시)를 작업 와이퍼(tissue paper)에 기울여챔버(도 S1)를통해 용액을 끌어들이는 데 도움을 줍니다. 그런 다음 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>2.2.2 단계에 설명된 대로 MB의 40 μL로 챔버를 세 번 세척</li>
		<li>시어드 셀 서스펜션(위 준비)의 40μL을 챔버 상단에 넣고 실온에서 10분 동안 배양하여 세포가 커버슬립에 부착할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>2.2.3에서와 같이 MB의 40 μL로 챔버를 부드럽게 플러시하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 회전 기록 및 정량화
	<ol>
<li>테더드 셀로 로드된 현미경 슬라이드를 현미경 단계로 옮는다.</li>
		<li>위상-대비 현미경 검사법과 100x 목표를 사용하여, 제자리에 고정된 셀의 인구를 스캔하고, 단일 축, 즉, 고정된 지점에서 매끄러운 회전을 하는 대신 초점이 안팎으로 이동하는 각도로 제시한다(비디오1).</li>
		<li>상업용 현미경 및 관련 카메라를 사용합니다. 관련 소프트웨어를 열고 관심 있는 셀이 포커스에 있는지 확인하고 비디오 수집을 클릭하여 1분 동안 셀 회전을 기록합니다(초당 10프레임 이상).</li>
		<li>비디오 재생에서 분당 전체 회전 수와 셀이 방향을 변경하는 횟수(스위칭 주파수)를 정량화합니다. 참고: 회전 속도 및 스위칭 주파수는 눈으로 측정하기에너무 빠를 수 있으므로 느리고 미세한 재생을 제공하는 비디오 소프트웨어를 사용하거나 회전패턴을정량화하기 위해 자동화된 소프트웨어 시스템을 채택하는 것이 좋습니다. 대안은 메틸 셀룰로오스 (또는 유사한 에이전트)를 사용하여 MB의 점도를 증가시켜 빠른 박테리아의 회전을 늦추고 해결하거나 프레임 레이트가 낮은 카메라가 사용중일 때 보상하는 것입니다.</li>
		<li>반복 단계 2.3.2 생물학적 복제와 관심의 인구의 표현을 컴파일합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 국경을 넘은 분석에서 떼 준비
참고: 돌연변이 또는 상태의 영향을 그룹 운동성에 평가하는 이 방법을 사용합니다. 군단-한천은 보통 연한 한천보다 비율이 높은 한천을 말합니다. 부드러운 한천(0.3%)에서 세포는 한천 내부에서 개별적으로 수영합니다. 무리 한천 (0.5% 이상)에서 세포는 표면에 그룹으로 이동합니다. 군단 플레이트는 여기에 상세한 대로 사용해야 하지만, 수영 플레이트는 유통 기한이 길어지며 며칠 동안 사용할 수 있습니다. 우리의 개인적인 취향은 1-2 일에 사용하는 것입니다.
<ol><li>
무리 의 천의 준비
	<ol>
<li>에이켄 한천 5g(0.5% w/v)과 LB 20g을 2L 라운드 하단 플라스크에 넣습니다. 플라스크에 ddH2O 1L을 넣고 교반봉과 자기 교반 플레이트를 사용하여 서스펜션을 균일하게 혼합합니다.</li>
		<li>121 °C에서 20 분 동안 오토 클레이브.</li>
		<li>위와 같이 막대/플레이트를 사용하여 기포를 피하기 위해 부드러운 교반으로 식힙니다. 약 50°C의 경우, 0.5%의 최종 농도를 위해 필터 멸균 포도당을 첨가한다.</li>
		<li>멸균 페트리 접시 (100mm x 15mm)에 25 mL을 붓고 적어도 14 시간 이상 20 시간 이하의 실온에서 설정할 수 있습니다. 나중에 사용할 수 있는 저장 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
떼 판의 접종 및 배양
	<ol>
<li>중기 기하 급수 문화의 6 μL (1.2에서와 같이 준비)은 한천 위에 발견하여 접종합니다.</li>
		<li>뚜껑을 5-10분 간 방치하고 접종이 천 표면으로 건조되면 교체하십시오.</li>
		<li>8 시간 동안 30 °C에서 배양하십시오. 이것은 천의 건조에 기여하고 무리를 손상으로, 뚜껑을 제거하여 무리 진행을 검사하는 유혹을 피하십시오. 참고: 인큐베이션 시간은 변형 표현형에 따라 달라질 수 있습니다. 몇몇 고립된 돌연변이는 떼어내고 있는 능력을 방해할 수 있고 한천의 감소된 백분율 또는 잠복의 더 긴 기간을 요구할 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
국경 횡단 분석 판의 준비 참고:이 분석은 플라스틱 분할(테두리)이하나(그림 2A)가아닌 두 개의 챔버를 생성하는 수정된 페트리 접시를 사용합니다. 각 챔버는 서로 독립적으로 준비할 수 있으며, 두 챔버를 '연결'하기 전에 서로 다른 조건을 제공합니다. 실험 설계에 따라, 제1 챔버(왼쪽 지정)는 박테리아가 국경을 넘어 강측으로 이동하여 포트 라고 +/- 필요한 보충제 또는 챌린지(예: 항생제)를 포함하는 오른쪽 챔버로 이동할 수 있는 수영 한천(0.3%w/v) 또는 군단 한천(0.5%w/v)으로 제조될 수 있습니다. 어느 한 천에 의이동은 일반적으로 접종의 원래 지점에서 세균 식민지 (가장자리에서 가장자리)의 가장 넓은 직경을 기록하여 측정 / 비교된다.<ol>
<li>필요한 경우 1.1에 설명된 대로 수영 한고를 준비하십시오.</li>
		<li>3.1에 설명된 대로 무리 한천을 준비한다.</li>
		<li>-30mL의 떼 한천(필요한 경우 원하는 보충제)을 이중 구획 페트리 접시(100mm x 15mm)의 오른쪽 챔버에 부어 챔버 사이의 플라스틱 분배기로 수평이 되지만 왼쪽으로 넘쳐나지는않습니다(그림 2B).</li>
		<li>한천이 경화된 후, 왼쪽 챔버를 ~30mL의 수영 또는 무리 한천으로 채우고, 플라스틱분할(도 2C)과의접촉 지점까지 다시 채우십시오. 설정하기 전에 멸균 파이펫 팁을 사용하여 원고를 테두리 위로 부드럽게 드래그하여 분할의 전체 길이에 걸쳐 있는 ~1mm 높이의 천교다리(도2D)와양면을 연결합니다.</li>
		<li>접시가 실온(3.1)에서 건조되도록 합니다. 참고: 다리를 만드는 다른 방법은 왼쪽 챔버 한가르가 건조한 다음 플라스틱 칸막이를 따라 용융 된 군단 천자의 100 μL을 천천히 피펫하여 두 챔버 (3.4)를 교개할 수 있도록 합니다. 수영 (1.2.2) 또는 군단 (3.2) 천에 대해 위에 상세한 바와 같이 왼쪽 챔버의 플레이트를 접종하고, 12-16 h에 대한 30 °C에서 배양하기 전에, 또는 무리가 관심있는 균주 사이의 비교를 허용하기 위해 오른쪽 챔버를 통해 충분한 진전을 이루었다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

억제제 돌연변이의 격리 및 특성화는화학기관시스템(35,36,37)의주요 성분을 식별하는 데 성공적으로 기여했으며, 모터기계자체(38,39,40)를확인하였다. 프로토콜 1을 사용하는 동안, 운동성의 손실을 보상 할 수있는 가능한 돌연변이의 큰 스펙트럼의 격리를 ?...

박테리아는 그들의 생태 틈새 시장1에서운동과 분산을 위해 많은 부속물을 사용합니다. Flagella 구동 운동성은 이들 중 가장 빠르며, 환경 신호에 대응하여 유리한 로케일의 식민지화를 촉진하고, 일부 종의 병원성 능력에 크게 기여하고있다2,3. 표기 박테리아는 벌크 액체에서 개별적으로 수영할 수 있으며, 반고체 표면4를통해 집단으로 떼지어질 수 있다. 세포외 기색은 멤브레인에 내장된 회전 모터에 의해 구동되며, 이온 그라데이션의 힘을 이용하여 회전1,2,4,5,6,7,8을유발하는 토크를 생성한다. 모터가 일정한 토크9에서실행되는 대장균에서모터 출력은 시계 반대 방향(CCW)과 시계 방향(CW) 방향으로 회전 속도 및 회전기의 전환 측면에서 분류될 수 있습니다. CCW 회전은 셀을 앞으로 추진하는 일관된 플래그엘라 번들의 형성을 촉진(run), 회전 방향(CW)의 일시적인 스위치는 번들이 부분적으로 또는 완전히10을분해하고, 셀은 수영 방향(tumble)을 재조정하도록 합니다. 대장균은 일반적으로 1초 동안 실행되고 10분의 1초 동안 공중제비합니다. 로터 또는 '텀블 바이어스'의 스위칭 주파수는 화학물질 신호 시스템에 의해 제어되며, 여기서 막 이상 화학 수용체는 외부 화학 신호를 감지하고 인포릴레이를 통해 기광모터로 전송하여 유인제에 대한 응답으로 실행을 확장하거나, 독성화학물질(11,12)에대응하여 이를 억제한다. 수영 운동성은 0.3% 부드러운 화창으로 분석됩니다.
무리하는 동안 박테리아는 조밀한 집단으로 반고체 표면을 탐색하며, 박테리아 팩은 연속 소용돌이 동작2,13,14,15로흐를 수 있습니다. 대장균 떼는 화학감각 생리학(낮은 텀블 바이어스), 더 높은 속도, 대량 액체16,17에서수영하는 세포에 대한 항균제에 대한 높은 내성을 나타낸다. Swarmers는 계면 활성제 생산, 과대 깃발 및 세포 연신2를포함하여 운동을 돕는 과다한 전략의 배치에 따라 다릅니다. S워밍업은 생태학적 및임상 설정18,19,20모두에서 박테리아에게 경쟁 우위를 제공합니다. swarmbacteria의 두 가지 범주가 있다: 온대 swarms, 0.5-0.8% 한천으로 고화 된 미디어에만 떼수, 그리고 강력한 swarms, 높은 한천 농도 를 통해 탐색할 수 있는21.
다양한 소의가 수영 운동성과 그 규제를 심문하기 위해 존재합니다. 돌연변이 또는 환경 조건에 의해 손상될 때, 운동성 자체는 기능의 이득 억제기 돌연변이를 확인하기 위한 강한 선택을 제공합니다. 이러한 억제제는 두 번째 돌연변이가 기능을 복원하는 원래 돌연변이 또는 의사 복귀제의 정품 역구일 수 있다. 이러한 돌연변이는 전체 게놈 시퀀싱(WGS)에 의해 식별될 수 있다. 편견없는 억제제 선택에 대한 대안은 편향된 표적 돌연변이 발생 전략(예를 들어, PCR 돌연변이 발생)입니다. 이러한 방법론은 종종 운동성 장치의 기능 또는 환경 조절에 빛을 비추는다. 모터 기능을 연구하는 것이 목표라면, 부드러운 한천에서 측정된 야생형 운동성의 복원이 반드시 야생형 모터 출력의 복원을 나타내는 것은 아닐 수 있습니다. 세포 테더링 분석, 세포가 단일 깃발에 의해 유리 표면에 부착되고 세포 체체의 회전이 이후에 모니터링되는, 모터 거동을 평가하기위한 선택의 초기 분석이 될 수 있습니다. 이제 모터 특성을 모니터링할 수 있는 보다 정교한 방법론이 가능하지만 모션 분석을 위해 필요한 고속 카메라 설정 및 적용으로인해 22,23,24,25의광범위한 사용이 제한됩니다. 셀 테더링 분석법은 기색증을 분리하여 유리 슬라이드에 짧은 필라멘트의 부착을 허용한 다음 셀 바디의 회전을 비디오 녹화해야 합니다. 기록된 모터 속도는 셀 체가 깃음에 미치는 높은 부하 때문에 이 분석에서 낮지만, 그럼에도 불구하고 이 분석은 화학 반응26,27,28,29에대한 귀중한 통찰력에 기여했으며, 아래에서 설명한 바와 같이 유효한 조사 도구로 남아 있다.
모성도를 따뜻하게 하는 것은 연구자에게 다른 도전과제를 제기합니다. 기능의 이득 억제기의 선택은 풍부한 계면 활성제와 쉽게13을생산하는 swarms에서만 작동합니다. 대장균과 같은 계면활성제 비생산자는환경의한천, 미디어 구성 및 습도의 선택에 대하여 까다로운2,13,14,21. 번들 조건이 설정되면, 국경 횡단 분석17은 새로운 / 가혹한 조건을 탐색 하는 군단의 능력을 심문 하는 유용한 방법론. 아래에 제시된 프로토콜은 대장균과관련이 있지만 다른 종의 응용 프로그램에 쉽게 적응할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eiken agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co. Japan</td>
			<td>E-MJ00</td>
			<td>Essential for E. coli swarming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D (+)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent software for microscope used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-285-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX53 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>For soft-agar assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>9908265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89200-944</td>
			<td>For border-crossing assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe - 1 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task/Tissue wipes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Or equivalent single use tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td>Or equivalent microscope camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

운동성은 많은 세균 종의 생존과 성공에 매우 중요합니다. 많은 방법론이 확산경로를 이해하고, 기조부품의 기능과 어셈블리를 해명하고, 움직임패턴을 조사하고 이해하기 위해 모틸성을 악용하기 위해 존재한다. 여기서 우리는 이러한 방법론의 세 가지 의 조합을 보여줍니다. 연한 한천의 운동성은 가장 오래된 것으로, 운동성 장애균의 기능 형 억제제 돌연변이를 격리하기 위한 강력한 선택을 제공하며, 여기서 운동성 조절은 두 번째 돌연변이를 통해 회복됩니다. 기체 모터의 회전 특성을 입증하기 위해 처음 채택된 셀 테더링 기술은 신호 이펙터가 모터 속도에 미치는 영향과 회전 방향을 전환하는 능력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. "국경 횡단"분석은 수영 박테리아가 무리로 집합적으로 이동으로 전환 할 준비가 될 수있는 최신입니다. 이 프로토콜은 함께 운동성 기계의 구성 요소를 식별하고 수영과 무리의 다양한 면에서 자신의 역할을 특성화하는 체계적이고 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 그(것)들은 그밖 세균성 종에 있는 운동성을 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.

그 운동성 신호 분자 c-di-GMP의 높은 수준에 의해 손상되는 대장균 긴장에서 의사 복귀제의 격리는, 우리의 실험실에서 최근 작업에서 상세히 되었다34. 이 균주(JP1442)는 ΔyhjH 및 ΔycgR의두 가지 돌연변이를 수용하였다. YhjH는 대장균에서c-di-GMP를 저하시키는 가장 활동적인 인포디세타이소입니다. YhjH의 부재는 상승 된 c-di-GMP 수준과 운동성의 억제로 이어...

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Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

많은 박테리아는 자신의 환경을 탐색하고 개별적으로 및 집단으로 모두 유리한 환경을 식민지화하기 위해 플래그텔라 구동 운동성을 사용합니다. 여기에 수영과 모성에 기여하는 구성 요소 / 경로를 식별하기 위해 선택 도구로 운동성을 활용하는 세 가지 확립 된 방법의 사용이 입증된다.

에슈리치아 대장균에서 모토렐라 구동 운동성 조사

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

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비디오: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

의 활동을 측정하는 어세이 대장균은 라이신 Decarboxyase을 Inducible

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

연구

생물학

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

구현을위한 프로토콜<em&gt; 대장균</em합성 생물학&gt;을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

라이브의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; O157 : PMA-qPCR에 의한 H7 셀

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.