يستخدم هذا البروتوكول الالتقاط الدقيق بالليزر إلى جانب تسلسل الحمض النووي الريبي للحصول على نسخ مكانية وزمنية من خلايا محددة في نباتات المصالح، وذلك باستخدام كميات صغيرة من المواد البيولوجية. الميزة الرئيسية لتقنية الليزر هي أنه يسهل التصور المباشر للخلايا داخل سياق الأنسجة الطبيعية ، مما يسمح للخلايا المنفصلة أن تكون معزولة بدقة بطريقة خالية من الاتصال. على الرغم من أن هذا البروتوكول هو الأمثل لعزل الخلايا النباتية، يمكن تطبيقه على معظم الخلايا التي يمكن التعرف عليها من الناحية البكانية.
إعداد عينة جيدة أمر بالغ الأهمية. لذلك، واحدة تنفيذ هذه التقنية للمرة الأولى، دعم التحسين من تثبيت الأنسجة وتضمين مهم قبل التقاط الليزر Microdissection. قبل جمع عينة الأنسجة، وإعداد تثبيت مناسبة للأنواع ونوع الأنسجة التي سيتم حصادها.
بالنسبة لبذورة الشعير، قم بقطع عينات البذور إلى النصف قبل غمر العينات في ما لا يقل عن 10 × حجم تثبيت الجليد البارد. استخدام فراغ التسلل لتسريع اختراق المثبت. الأنسجة يجب أن تغرق في نهاية التسلل، ثم تحديث التثبيت لاحتضان ليلة وضحاها ونقل العينات إلى أشرطة لمعالجة الأنسجة.
ضع الكاسيتات المحملة بالأنسجة في السلة المعدنية لمعالج أوتوماتيكي واربط السلة المعدنية بصاحبها فوق الغرفة الواحدة. تعيين البرنامج على لوحات التحكم في المعالج الأنسجة والصحافة بدء لبدء برنامج المعالجة التلقائي. وسوف يجفف النظام العينات عن طريق غمس الكاسيتات في سلسلة متدرجة من الإيثانول لمدة 90 دقيقة لكل تركيز كما هو مبين.
وبعد الغمر الأخير بالإيثانول، سيقوم النظام بغمر العينات في تدرجات من الزيلين لمدة 90 دقيقة لكل حل كما هو مبين. تليها 290 دقيقة الغمر في البارافين المنصهر في 55 إلى 60 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي، وإزالة البارافين تسللت أشرطة من معالج الأنسجة والمضي قدما في تضمين البارافين.
في صباح اليوم التالي، استخدم ملقط غرامة لنقل عينات العملية إلى قوالب الحجم المناسب وإضافة البارافين المنصهر على كل عينة. بالنسبة لبذور الشعير، قم بتوجيه العينات في البارافين طولياً إلى اتجاه القطع لتسهيل الحصول على المقاطع الطولية. ضع كاسيتًا نظيفًا على القالب وتأكد من أن الكاسيت بأكمله مغطى بالكامل بحجم كافٍ من البارافين لتأمين العينة إلى الكاسيت.
ثم ضع القالب على طبق بارد لمدة 10 إلى 20 دقيقة حتى يتم تعيين البارافين قبل تحرير الكتلة من القالب. لإعداد شرائح غشاء القلم، غمر الشرائح في محلول تعطيل RNS لمدة ثلاث ثوانٍ متبوعة بغسلات قصيرة والمياه المعالجة DEPC. ثم محرك الشرائح في حاضنة 370 درجة مئوية لإزالة أي حل بقايا والأشعة فوق البنفسجية علاج الشرائح في مجلس الوزراء تدفق لارينار لمدة 30 دقيقة لتعزيز البارافين لا البندق.
لعينة من الأنسجة اقسام مكان كتل البارافين على لوحة باردة وملء حمام الماء مع المياه المعالجة DEPC، ثم الحارة إلى 42 درجة مئوية. كتل تقليم إلى عمق المنطقة من الفائدة وقسم كتل البارافين إلى سمك ستة إلى 10 ميكرون. كتلة مقطعة جيدا سوف تشكل شريط على حافة النصل.
استخدم ملاقطة دقيقة لنقل شرائط من الدقيقة إلى حمام الماء بلطف، مع الحرص على أن يضع الشريط مسطحة على سطح الماء. لجمع المقاطع، مع عقد شريحة في زاوية 45 درجة، واستخدام حركة التصاعدي لرفع الشريط من الماء على الشريحة واستخدام نسيج خال من الوبر لإزالة بعناية المياه الزائدة. عندما تم جمع جميع الأقسام، وغسل الشرائح مع غسل 320 ثانية في إكسيلين تليها 230 ثانية يغسل في 100٪ الإيثانول و 230 يغسل ثانية في 70٪ الإيثانول.
لmicrodissect الخلايا ذات الأهمية من أقسام الأنسجة deparraffinized والجافة ، تحميل الشرائح على فتحات المجهر LCM الثلاث وتحميل أنبوب جمع في الفتحات المتاحة. نقل المرحلة لتحديد موقع المنطقة من العينة التي تحتاج إلى قطع وقطع قطعة فارغة خالية من الأنسجة على الشريحة الغشاء. لتحسين سرعة القطع والقطع في ضغط الليزر الطاقة والتركيز.
استخدام أدوات الرسم لتحديد المنطقة ذات الاهتمام في الأنسجة واستخدام المعلمات الأمثل ووظيفة LPC روبو إلى الخلايا المنجنيق في قبعات لاصقة. حدد علامة من قائمة العناصر لاستخدام أداة العلامة لوضع علامة على المناطق التي تهمك. تحقق من زر فحص الغطاء لفحص الغطاء اللاصق ، للتأكد من أنه تم التقاط العينات.
وعادة ما تكون هناك حاجة إلى 10 إلى 15 قسما لكل غطاء لاستخراج الحمض النووي الريبي. مباشرة بعد الحصول على جميع العينات، انتقل فورا لاستخراج الحمض النووي الريبي لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي. بعد استخراج الحمض النووي الريبي والتضخيم RNA استخدام نظام كهربائي الآلي، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتحديد كمي وتأهيل الحمض النووي الريبي.
في هذه الدراسة، LCM، تم تطبيق تسلسل الحمض النووي الريبي على عدد قليل من الخلايا من ثلاثة أعضاء الجنين، كل ثماني ساعات على مدى 48 ساعة دورة زمنية أثناء الإنبات. من المهم ضبط معلمات القطع بشكل صحيح للسماح بقطع الأنسجة ذات الاهتمام بدقة وخلعها من الأنسجة المحيطة دون حرق حافة المنطقة المختارة. تفرع من مجموع الجيش الملكي النيبالي قبل تضخيم RNA يسمح الكشف عن عصابات كهربية متميزة وقمم الفلورسنت من 18 و 28S وحدات فرعية الريبوزومية في عينات الحمض النووي الريبي ذات نوعية جيدة.
سوف توليفها بنجاح المضادة للنادس RNA يحمل توزيع حجم متماثل الأحادي الواسطة من 100 إلى 1000 نوكليوتيدات مع ذروة حول 300 النيوكليوتيدات بعد جولتين من التضخيم. متعدد الأبعاد رسم مقياس الجينات التي أعرب عنها في الأنسجة المختلفة على مدى 48 ساعة من الإنبات، ويوضح وجود تشابه أكبر بين عينات من نسيج واحد مما بين العينات من نفس النقطة الزمنية، ولكن الأنسجة المختلفة. عدد الجينات التي يعبر عنها بشكل تفاضلي يزداد تدريجيا على مدى الإنبات في كل نسيج نسبة إلى نقطة ساعة الصفر من الوقت من الأنسجة.
في هذا التحليل التمثيلي، تم العثور على 25٪ من البلوم، 34٪ من الشعاع و 41٪ من الجينات التي تم التعبير عنها بشكل تفاضلي أن تكون عبرت حصرا داخل كل نسيج. من المهم ضبط المعلمات القطع بشكل صحيح لختان دقيق وخلع منطقة المحدد من الأنسجة المحيطة دون حرق حافة المنطقة المختارة. مع تحسين كروماتين وأساليب تنقية البروتين، وتعزيز أداة قياس الطيف الشامل، LCM يمكن استخدامها لنوع الخلية زراعة دراسات الجينومية والبروتيومومية محددة.
