Bu protokol, rna-sıralama ile birleştiğinde lazer yakalama mikrodiszesini kullanarak, az miktarda biyolojik malzeme kullanarak, ilgi alanlarındaki bitkilerdeki belirli hücrelerden Mekansal ve Zamansal transkripsiyonlar elde eder. Lazer tekniğinin en büyük avantajı, hücrelerin normal doku bağlamında doğrudan görselleştirilmesini kolaylaştırarak, ayrık hücrelerin temassız bir şekilde tam olarak izole edilebilmesidir. Bu protokol bitki hücrelerinin izolasyonu için optimize edilmiş olsa da, stolojik olarak tanımlanabilen çoğu hücreye uygulanabilir.
İyi numune hazırlama çok önemlidir. Bu nedenle, ilk kez bu tekniği gerçekleştiren bir, doku fiksasyonu prop optimizasyonu ve katıştırma Lazer-Yakalama Mikrodiseksiyon önce önemlidir. Doku örneğini toplamadan önce, hasat edilecek tür ve doku tipine uygun bir fiksatif hazırlayın.
Arpa tohumu için, en az 10 X buz soğuk fiksatif içine örnekleri batırarak önce ikiye tohum örnekleri kesti. Fiksatif penetrasyon hızlandırmak için vakum infiltrasyon kullanın. Doku infiltrasyon sonunda lavabo, daha sonra bir gecede kuluçka için fiksatif yenilemek ve doku işleme için kasetler içine örnekleri aktarmak gerekir.
Doku yüklü kasetleri otomatik işlemcinin metal sepetine yerleştirin ve metal sepeti birinci odanın üstündeki tutucuya takın. Programı doku işlemcisinin kontrol panellerine ayarlayın ve otomatik işleme programını başlatmak için basın. Sistem, kasetleri belirtilen konsantrasyon başına 90 dakika boyunca bir degrade etanol serisine batırarak numuneleri susuz düşürecektir.
Son etanol daldırma sonra, sistem belirtildiği gibi çözelti başına 90 dakika ksilen gradyanlarda örnekleri batırılır. Ardından 55 ila 60 santigrat derecede erimiş parafin 290 dakika daldırma. Ertesi sabah, doku işlemcisinden parafin sızmış kasetleri çıkarın ve parafin gömme işlemine devam edin.
Ertesi sabah, proses örneklerini uygun büyüklükteki kalıplara aktarmak ve her numunenin üzerine erimiş parafin eklemek için ince çerkezlikler kullanın. Arpa tohumları için, parafindeki numuneleri uzunlamasına kesitlerin elde edilmesine kolaylaştırmak için kesme yönüne yönlendirin. Kalıba temiz bir kaset yerleştirin ve numuneyi kasete sabitlemek için tüm kasetin yeterli miktarda parafinle kaplandığını sağlayın.
Daha sonra kalıbı, kalıptan bloke çıkarmadan önce parafin ayarlanana kadar 10 ila 20 dakika soğuk bir tabağa yerleştirin. PEN Membran Slaytları hazırlamak için, RNS deaktivasyon çözeltisindeki slaytları üç saniye batırın ve ardından iki kısa yıkar ve DEPC arıtılmış su layın. Sonra herhangi bir artık çözüm kaldırmak için 370 derece santigrat santigrat inkübatör slaytlar sürücü ve UV 30 dakika boyunca bir laminar akış kabini slaytlar tedavi fındık değil parafin geliştirmek için.
Bir örnek doku kesitiçin soğuk plaka üzerine parafin blokları yerleştirin ve DEPC arıtılmış su ile su banyosu doldurun, sonra 42 santigrat derece sıcak. İlgi bölgesinin derinliğine kadar kırpma blokları ve altı ila 10 mikron kalınlığında parafin blokları bölüm. İyi kesitli bir blok bıçağın kenarında bir şerit oluşturacaktır.
Kurdelenin su yüzeyinde düz bir şekilde uzanmasını göz önünde bulundurarak, kurdeleleri mikrotomdan su banyosuna yavaşça aktarmak için ince bir cılızlaştırıcı kullanın. Bölümleri toplamak için, 45 derecelik bir açıyla bir slayt tutarak, slayt üzerine sudan bir şerit kaldırmak için yukarı doğru bir hareket kullanın ve dikkatle fazla su kaldırmak için bir tiftik serbest doku kullanın. Tüm bölümler toplandığında, slaytları ksilen'de 320 saniyelik yıkama ile yıkayın ve ardından %100 etanolde 230 saniye yıkama ve %70 etanolde 230 saniye yıkama.
Deparraffinized ve kuru doku bölümlerinden ilgi hücreleri mikrodissect için, üç LCM mikroskop yuvaları ve mevcut yuvaları içine yükleme toplama tüpü slaytlar yükleyin. Membran kaydırağında dokusuz boş bir parçakesilmesi ve kesilmesi gereken numunenin bölgesini bulmak için sahneyi hareket ettirin. Lazer basıncımancitleme enerjisi ve odak kesme hızı ve kesme optimize etmek için.
Dokudaki ilgi alanını anahat haline getirmek için çizim araçlarını kullanın ve hücreleri yapışkan kapaklara mancınık lamak için optimize edilmiş parametreleri ve Robo LPC işlevini kullanın. İlgi çekici bölgeleri işaretlemek için bayrak aracını kullanmak için öğeler listesinden bayrak seçin. Örneklerin yakalandığını doğrulamak için yapışkan kapağı incelemek için kapak denetim düğmesini kontrol edin.
RNA ekstraksiyonu için genellikle kapak başına 10 ila 15 bölüm gereklidir. Tüm numuneler alındıktan hemen sonra, RNA bozulmasını önlemek için derhal RNA ekstraksiyonuna devam edin. RNA ekstraksiyon ve RNA amplifikasyon sonra ölçülmesi ve antisense RNA nitelemek için üreticinin talimatlarına göre, otomatik bir elektroforez sistemi kullanın.
Bu çalışmada, LCM, RNA-sıralama üç embriyo organlarından hücrelerin az sayıda uygulandı, çimlenme sırasında 48 saatlik bir zaman ders boyunca her sekiz saatte bir. Kesme parametrelerini doğru şekilde ayarlamak, ilgi çeken dokunun seçilen alanın kenarını yakmadan çevre dokudan hassas bir şekilde kesilmesini ve yerinden çıkarılabilmesiiçin önemlidir. RNA amplifikasyon önce toplam RNA ramification kaliteli RNA örneklerinde farklı elektroforetik bantlar ve 18 ve 28S ribozomal alt birimlerin floresan zirvelerin tespiti sağlar.
Başarıyla sentezlenen antisense RNA amplifikasyon iki tur sonra yaklaşık 300 nükleotit ile 100 ila 1000 nükleotitler bir unimodal simetrik boyut dağılımı sergileyecek. 48 saatlik çimlenme süresi boyunca farklı dokularda ifade edilen genlerin çok boyutlu ölçek çizimi, tek doku örnekleri arasında aynı zaman noktasından alınan örneklerden, ancak farklı dokulardan daha büyük bir benzerlik göstermektedir. Farklı ifade genlerin sayısı doku sıfır saat zaman noktasına göre her dokuda çimlenme boyunca giderek artar.
Bu temsili analizde plumule'nin %25'i, raküllerin %34'ü ve scutellum un %41'inin farklı olarak ifade edilmiş genlerin her dokuda münhasıran ifade edildiği saptanmıştır. Seçilen bölgenin kenarını yakmadan seçici alanın hassas bir eksizyon ve çevre dokudan ayrıtılması için kesme parametrelerini doğru bir şekilde ayarlamak önemlidir. Geliştirilmiş kromatin ve protein arınma yöntemleri ile, ve kütle spektrometresi aracı geliştirmek, LCM hücre tipi özel epigenomik ve proteomik çalışmalar implantlar için kullanılabilir.
