Dieses Protokoll verwendet Laser-Capture Microdissection gekoppelt mit RNA-Sequenzierung, um räumliche und zeitliche Transkriptome von bestimmten Zellen in Interessenpflanzen zu erhalten, wobei kleine Mengen biologischer Materialien verwendet werden. Der Hauptvorteil der Lasertechnik besteht darin, dass sie die direkte Visualisierung von Zellen im normalen Gewebekontext erleichtert, so dass die diskreten Zellen berührungslos präzise isoliert werden können. Obwohl dieses Protokoll für die Isolierung von Pflanzenzellen optimiert ist, kann es auf die meisten Zellen angewendet werden, die stologisch identifiziert werden können.
Eine gute Probenvorbereitung ist entscheidend. Daher ist eine, die diese Technik zum ersten Mal durchführt, die Stützoptimierung der Gewebefixierung und der Einbettung vor der Laser-Capture Microdissection wichtig. Vor dem Sammeln der Gewebeprobe, bereiten Sie ein Fixativ entsprechend der Art und Gewebetyp zu ernten.
Bei Gerstensamen die Samenproben halbieren, bevor Sie die Proben in mindestens ein 10-fache Eiskaltfixierungsvolumen untertauchen. Verwenden Sie Vakuuminfiltration, um das Eindringen des Fixiativs zu beschleunigen. Das Gewebe sollte am Ende der Infiltration sinken, dann das Fixativ für eine nächtliche Inkubation auffrischen und die Proben in Kassetten für die Gewebeverarbeitung übertragen.
Legen Sie die mit Gewebe beladenen Kassetten in den Metallkorb eines automatischen Prozessors und befestigen Sie den Metallkorb an seinem Halter über Kammer eins. Stellen Sie das Programm auf den Bedienfeldern des Tissueprozessors ein und drücken Sie den Start, um das automatische Verarbeitungsprogramm zu starten. Das System dehydriert die Proben, indem es die Kassetten für 90 Minuten pro Konzentration in eine Gradientenserie von Ethanol eintaucht, wie angegeben.
Nach dem letzten Ethanol-Eintauchen taucht das System die Proben wie angegeben 90 Minuten pro Lösung in Xylol-Gradienten unter. Gefolgt von 290 Minuten Eintauchen in geschmolzenes Paraffin bei 55 bis 60 Grad Celsius. Am nächsten Morgen entfernen Sie die paraffininierten Kassetten aus dem Gewebeprozessor und fahren Sie zur Paraffineinbettung fort.
Verwenden Sie am nächsten Morgen feine Zangen, um die Prozessproben in entsprechend große Formen zu übertragen und geschmolzenes Paraffin über jede Probe zu geben. Bei Gerstensamen die Proben im Paraffin längs an der Schnittrichtung ausrichten, um den Erwerb von Längsschnitten zu erleichtern. Legen Sie eine saubere Kassette auf die Form und stellen Sie sicher, dass die gesamte Kassette vollständig mit einer ausreichenden Menge Paraffin bedeckt ist, um das Sample an der Kassette zu befestigen.
Legen Sie die Form dann 10 bis 20 Minuten auf eine kalte Platte, bis das Paraffin eingestellt ist, bevor Sie den Block aus der Form lösen. Um eine PEN-Membran-Folien vorzubereiten, tauchen Sie die Dias für drei Sekunden in die RNS-Deaktivierungslösung ein, gefolgt von zwei kurzen Wäbungen und DEPC-behandeltem Wasser. Fahren Sie dann die Dias in einem 370 Grad Celsius Inkubator, um jede übrig gebliebene Lösung zu entfernen und UV behandeln Sie die Dias in einem laminaren Strömungsschrank für 30 Minuten, um ihre Paraffin nicht Haselnüsse zu verbessern.
Für eine Probengewebesektion die Paraffinblöcke auf die kalte Platte legen und das Wasserbad mit dem DEPC-behandelten Wasser füllen, dann auf 42 Grad Celsius erwärmen. Schneiden Sie die Blöcke auf die Tiefe des Interessenbereichs und schneiden Sie die Paraffinblöcke auf eine Dicke von sechs bis zehn Mikrometern. Ein gut geschnittener Block bildet ein Band am Rand der Klinge.
Verwenden Sie eine feine Pinzette, um Bänder sanft vom Mikrotome in das Wasserbad zu übertragen, wobei darauf zu achten ist, dass das Band flach auf der Wasseroberfläche liegt. Um die Abschnitte zu sammeln, halten Sie eine Rutsche in einem 45-Grad-Winkel, verwenden Sie eine Aufwärtsbewegung, um ein Band aus dem Wasser auf die Rutsche zu heben und verwenden Sie ein fusselfreies Gewebe, um das überschüssige Wasser vorsichtig zu entfernen. Wenn alle Abschnitte gesammelt wurden, waschen Sie die Dias mit 320 Sekunden Wäsche in Xylol, gefolgt von 230 Sekunden Wäsche in 100%Ethanol und 230 Sekunden Waschen in 70% Ethanol.
Um Zellen von Interesse aus den entparraffinierten und trockenen Gewebeabschnitten zu mikrosektieren, legen Sie die Schlitten auf die drei LCM-Mikroskopschlitze und das Lastsammelrohr in die verfügbaren Schlitze. Bewegen Sie die Stufe, um den Bereich der Probe zu lokalisieren, der geschnitten werden muss, und schneiden Sie ein leeres Segment frei von Gewebe auf dem Membranschlitten. Optimierung der Schnittgeschwindigkeit und des Schneidens im Laserdruck katapultieren Energie und Fokus.
Verwenden Sie die Zeichenwerkzeuge, um den Bereich des Interesses am Gewebe zu skizzieren und die optimierten Parameter und die Robo LPC-Funktion zu verwenden, um Zellen in die Klebekappen zu katapultieren. Wählen Sie Flag aus der Elementliste aus, um das Flag-Tool zum Markieren der interessenden Regionen zu verwenden. Überprüfen Sie die Kappenprüftaste, um die Klebekappe zu überprüfen, um zu bestätigen, dass die Proben entnommen wurden.
Typischerweise sind 10 bis 15 Abschnitte pro Kappe für die RNA-Extraktion erforderlich. Unmittelbar nachdem alle Proben erworben wurden, gehen Sie sofort zur RNA-Extraktion, um einen RNA-Abbau zu vermeiden. Nach der RNA-Extraktion und RNA-Verstärkung verwenden Sie ein automatisiertes Elektrophorese-System, nach den Anweisungen des Herstellers, um die Antisense-RNA zu quantifizieren und zu qualifizieren.
In dieser Studie, LCM, RNA-Sequenzierung wurde auf eine kleine Anzahl von Zellen aus drei Embryo-Organen angewendet, alle acht Stunden über einen 48-Stunden-Zeitkurs während der Keimung. Es ist wichtig, die Schnittparameter richtig einzustellen, damit das Gewebe von Interesse präzise geschnitten und aus dem umgebenden Gewebe entfernt werden kann, ohne den Rand des ausgewählten Bereichs zu verbrennen. Die Verzweigung der gesamten RNA vor der RNA-Verstärkung ermöglicht den Nachweis von unterschiedlichen elektrophoretischen Bändern und Fluoreszenzspitzen von 18 und 28S ribosomalen Untereinheiten in hochwertigen RNA-Proben.
Erfolgreich synthetisierte Antisense-RNA wird eine unimodale symmetrische Größenverteilung von 100 bis 1000 Nukleotiden mit einem Spitzenwert von etwa 300 Nukleotiden nach zwei Verstärkerrunden aufweisen. Die mehrdimensionale Maßstabsdarstellung von Genen, die in den verschiedenen Geweben über 48 Stunden Keimung exprimiert werden, veranschaulicht eine größere Ähnlichkeit zwischen Proben eines einzelnen Gewebes als zwischen Proben aus demselben Zeitpunkt, aber unterschiedlichen Geweben. Die Anzahl der differenziell exprimierten Gene nimmt im Laufe der Keimung in jedem Gewebe im Verhältnis zum Null-Stunden-Zeitpunkt des Gewebes schrittweise zu.
In dieser repräsentativen Analyse wurden 25 % der Plumule, 34 % der Radikel und 41 % der scutellum differenziell exprimierten Gene ausschließlich in jedem Gewebe exprimiert. Es ist wichtig, die Schnittparameter für eine präzise Ausscheidung und Abscheidung des Selektorbereichs aus dem umgebenden Gewebe korrekt einzustellen, ohne den Rand des ausgewählten Bereichs zu verbrennen. Mit verbesserten Chromatin- und Proteinreinigungsmethoden und einem verbesserten Massenspektrometrie-Instrument kann LCM für zelltypspezifische epigenomische und Proteomik-Studienimplantate verwendet werden.
