Este protocolo utiliza la Microdisección de Captura Láser junto con la secuenciación de ARN para obtener transcriptomas espaciales y temporales de células específicas en plantas de interés, utilizando pequeñas cantidades de materiales biológicos. La principal ventaja de la técnica láser es que facilita la visualización directa de las células dentro del contexto normal del tejido, permitiendo que las células discretas se aíslen con precisión de manera libre de contacto. Aunque este protocolo está optimizado para el aislamiento de células vegetales, se puede aplicar a la mayoría de las células que se pueden identificar esteológicamente.
Una buena preparación de la muestra es fundamental. Por lo tanto, uno realizando esta técnica por primera vez, la optimización de la utilería de la fijación del tejido y la incrustación es importante antes de la microdisección de captura láser. Antes de recoger la muestra de tejido, preparar un fijador adecuado a la especie y el tipo de tejido a cosechar.
Para la semilla de cebada, corte las muestras de semillas por la mitad antes de sumergir las muestras en al menos un volumen de 10 X de fijador frío. Utilice la infiltración de vacío para acelerar la penetración del fijador. El tejido debe hundirse al final de la infiltración, luego refrescar el fijador para una incubación durante la noche y transferir las muestras a casetes para el procesamiento de tejidos.
Coloque los cassettes cargados de tejido en la cesta metálica de un procesador automático y coloque la cesta metálica en su soporte por encima de la cámara uno. Ajuste el programa en los paneles de control del procesador de tejidos y pulse start para iniciar el programa de procesamiento automático. El sistema deshidratará las muestras sumergiendo los casetes en una serie de gradientes de etanol durante 90 minutos por concentración como se indica.
Después de la última inmersión de etanol, el sistema sumergirá las muestras en gradientes de xileno durante 90 minutos por solución como se indica. Seguido de inmersiones de 290 minutos en parafina fundida a 55 a 60 grados centígrados. A la mañana siguiente, retire los casetes infiltrados de parafina del procesador de tejidos y proceda a la incrustación de parafina.
A la mañana siguiente, utilice fórceps finos para transferir las muestras de proceso a moldes de tamaño adecuado y agregue parafina fundida sobre cada muestra. Para las semillas de cebada, oriente las muestras en la parafina longitudinalmente a la dirección de corte para facilitar la adquisición de secciones longitudinales. Coloque un cassette limpio en el molde y asegúrese de que todo el cassette esté completamente cubierto con un volumen suficiente de parafina para fijar la muestra al cassette.
A continuación, coloque el molde en una placa fría durante 10 a 20 minutos hasta que la parafina se ajuste antes de liberar el bloque del molde. Para preparar una diapositiva de membrana PEN, sumerja los portaobjetos en la solución de desactivación de RNS durante tres segundos seguido de dos breves lavados y agua tratada con DEPC. A continuación, conduzca los portaobjetos en una incubadora de 370 grados Celsius para eliminar cualquier solución sobrante y uv tratar los portaobjetos en un armario de flujo laminar durante 30 minutos para mejorar su parafina no avellanas.
Para una sección de tejido de muestra coloque los bloques de parafina en la placa fría y llene el baño de agua con el agua tratada con DEPC, luego caliente a 42 grados Celsius. Recortar bloques a la profundidad de la región de interés y secciones de los bloques de parafina a un espesor de seis a 10 micras. Un bloque bien seccionado formará una cinta en el borde de la hoja.
Utilice una pinza fina para transferir suavemente cintas desde el microtomo al baño de agua, teniendo cuidado de que la cinta se coloque plana en la superficie del agua. Para recoger las secciones, sosteniendo un portaobjetos en un ángulo de 45 grados, utilice un movimiento hacia arriba para levantar una cinta fuera del agua sobre el portaobjetos y utilice un tejido libre de pelusas para eliminar cuidadosamente el exceso de agua. Una vez recogidas todas las secciones, lave los portaobjetos con lavados de 320 segundos en xileno seguidos de lavados de 230 segundos en 100% etanol y 230 segundos lavados en 70% etanol.
Para microdiseccionar las células de interés de las secciones de tejido desparafinanizado y seco, cargue los portaobjetos en las tres ranuras del microscopio LCM y cargue el tubo de recogida en las ranuras disponibles. Mueva el escenario para localizar la región de la muestra que necesita ser cortada y cortar un segmento en blanco libre de tejido en la diapositiva de la membrana. Optimizar la velocidad de corte y el corte en la presión láser catapultando energía y enfoque.
Utilice las herramientas de dibujo para esbozar el área de interés en el tejido y utilizar los parámetros optimizados y la función Robo LPC para catapultar las células en las tapas adhesivas. Seleccione la marca de la lista de elementos para utilizar la herramienta de indicador para marcar las regiones de interés. Compruebe el botón de comprobación de la tapa para inspeccionar la tapa adhesiva, para confirmar que las muestras han sido capturadas.
Normalmente se requieren de 10 a 15 secciones por tapa para la extracción de ARN. Inmediatamente después de que todas las muestras hayan sido adquiridas, proceda inmediatamente a la extracción de ARN para evitar la degradación del ARN. Después de la extracción de ARN y amplificación de ARN utilizar un sistema automatizado de electroforesis, de acuerdo con las instrucciones del fabricante para cuantificar y calificar el ARN antisens sentido.
En este estudio, LCM, la secuenciación de ARN se aplicó a un pequeño número de células de tres órganos embrionarios, cada ocho horas durante un curso de 48 horas durante la germinación. Es importante ajustar los parámetros de corte correctamente para permitir que el tejido de interés se corte y desaloje con precisión del tejido circundante sin quemar el borde del área seleccionada. La ramificación del ARN total antes de la amplificación del ARN permite la detección de bandas electroforéticas y picos fluorescentes distintos de las subunidades ribosomales 18 y 28S en muestras de ARN de buena calidad.
El ARN antisrésense sintetizado con éxito exhibirá una distribución de tamaño simétrico unimodal de 100 a 1000 nucleótidos con un pico de alrededor de 300 nucleótidos después de dos rondas de amplificación. El trazado a escala multidimensional de genes expresados en los diferentes tejidos a lo largo de 48 horas de germinación, ilustra una mayor similitud entre las muestras de un solo tejido que entre las muestras del mismo punto de tiempo, pero diferentes tejidos. El número de genes expresados diferencialmente aumenta progresivamente en el transcurso de la germinación en cada tejido en relación con el punto de tiempo de hora cero del tejido.
En este análisis representativo, se encontró que el 25% de la plolo, el 34% del radio y el 41% de los genes expresados diferencialmente en el escutellio se expresaban exclusivamente dentro de cada tejido. Es importante ajustar correctamente los parámetros de corte para una escisión precisa y el desalojamiento del área selectora del tejido circundante sin quemar el borde de la región seleccionada. Con métodos mejorados de purificación de cromatina y proteínas, y mejorar el instrumento de espectrometría de masas, LCM se puede utilizar para estudios epigenómicos y proteómicos específicos de tipo celular.
