Ce protocole utilise la microdissection laser-capture couplée au séquençage arn pour obtenir des transcriptomes spatiaux et temporels à partir de cellules spécifiques dans des plantes d’intérêt, en utilisant de petites quantités de matériaux biologiques. Le principal avantage de la technique laser est qu’elle facilite la visualisation directe des cellules dans un contexte tissulaire normal, permettant aux cellules discrètes d’être précisément isolées sans contact. Bien que ce protocole soit optimisé pour l’isolement des cellules végétales, il peut être appliqué à la plupart des cellules qui peuvent être stologically identifiées.
Une bonne préparation de l’échantillon est essentielle. Par conséquent, l’un effectuant cette technique pour la première fois, l’optimisation des accessoires de la fixation des tissus et l’intégration est important avant laser-capture microdissection. Avant de prélever l’échantillon de tissu, préparer un fixatif approprié à l’espèce et au type de tissu à récolter.
Pour les graines d’orge, couper les échantillons de graines en deux avant de les insumer dans au moins un volume de 10 X de fixatif glacé. Utilisez l’infiltration sous vide pour accélérer la pénétration du fixatif. Le tissu doit couler à la fin de l’infiltration, puis rafraîchir le fixatif pour une incubation pendant la nuit et transférer les échantillons dans des cassettes pour le traitement des tissus.
Placez les cassettes chargées de tissu dans le panier métallique d’un processeur automatique et fixez le panier métallique à son support au-dessus de la chambre 1. Réglez le programme sur les panneaux de contrôle du processeur de tissu et appuyez sur commencer le programme de traitement automatique. Le système déshydratera les échantillons en plongeant les cassettes dans une série de gradient d’éthanol pendant 90 minutes par concentration, comme indiqué.
Après la dernière immersion d’éthanol, le système submergera les échantillons dans des gradients de xylène pendant 90 minutes par solution comme indiqué. Suivi d’immersions de 290 minutes en paraffine fondue à 55 à 60 degrés Celsius. Le lendemain matin, retirez les cassettes infiltrées par la paraffine du processeur tissulaire et passez à l’intégration de la paraffine.
Le lendemain matin, utilisez des forceps fins pour transférer les échantillons de procédé dans des moules de taille convenable et ajouter de la paraffine fondue sur chaque échantillon. Pour les graines d’orge, orientez les échantillons dans la paraffine longitudinalement vers la direction de coupe afin de faciliter l’acquisition de sections longitudinales. Placez une cassette propre sur le moule et assurez-vous que toute la cassette est entièrement recouverte d’un volume suffisant de paraffine pour fixer l’échantillon à la cassette.
Ensuite, placez le moule sur une plaque froide pendant 10 à 20 minutes jusqu’à ce que la paraffine soit réglée avant de libérer le bloc du moule. Pour préparer une toboggan membrane PEN, submergez les glissières dans la solution de désactivation RNS pendant trois secondes, suivies de deux brefs lavages et de l’eau traitée par le DEPC. Ensuite, conduisez les glissières dans un incubateur de 370 degrés Celsius pour enlever les restes de solution et uv traiter les diapositives dans un coffret d’écoulement laminaire pendant 30 minutes pour améliorer leur paraffine pas noisettes.
Pour un échantillon de tissu sectionnant placer les blocs de paraffine sur la plaque froide et remplir le bain d’eau avec l’eau traitée DEPC, puis chaud à 42 degrés Celsius. Couper les blocs à la profondeur de la région d’intérêt et sectionne les blocs de paraffine à une épaisseur de six à 10 microns. Un bloc bien sectionné formera un ruban au bord de la lame.
Utilisez une pince fine pour transférer doucement les rubans du microtome au bain d’eau, en prenant soin que le ruban se pose à plat à la surface de l’eau. Pour recueillir les sections, en tenant une glissière à un angle de 45 degrés, utilisez un mouvement vers le haut pour soulever un ruban hors de l’eau sur la lame et utilisez un tissu sans peluche pour enlever soigneusement l’excès d’eau. Lorsque toutes les sections ont été recueillies, lavez les glissières avec des lavages de 320 secondes au xylène, suivis de 230 secondes de lavage à 100 % d’éthanol et de lavages de 230 secondes dans 70 % d’éthanol.
Pour microdissect les cellules d’intérêt des sections de tissus déparraffinés et secs, chargez les diapositives sur les trois fentes de microscope LCM et le tube de collecte de charge dans les fentes disponibles. Déplacez la scène pour localiser la région de l’échantillon qui doit être coupée et coupez un segment vierge exempt de tissu sur la lame membranaire. Optimiser la vitesse de coupe et la coupe de la pression laser catapultant l’énergie et la concentration.
Utilisez les outils de dessin pour décrire la zone d’intérêt pour le tissu et utiliser les paramètres optimisés et la fonction Robo LPC pour catapulter les cellules dans les bouchons adhésifs. Sélectionnez le drapeau de la liste des éléments pour utiliser l’outil drapeau pour marquer les régions d’intérêt. Vérifiez le bouton de vérification du bouchon pour inspecter le bouchon adhésif, pour confirmer que les échantillons ont été capturés.
En général, 10 à 15 sections par bouchon sont nécessaires pour l’extraction de l’ARN. Immédiatement après l’acquisition de tous les échantillons, procéder immédiatement à l’extraction de l’ARN afin d’éviter la dégradation de l’ARN. Après l’extraction de l’ARN et l’amplification de l’ARN utiliser un système automatisé d’électrophoresis, selon les instructions du fabricant pour quantifier et qualifier l’ARN antisens.
Dans cette étude, LCM, arn-séquençage a été appliqué à un petit nombre de cellules de trois organes embryonnaires, toutes les huit heures sur un cours de temps de 48 heures pendant la germination. Il est important d’ajuster correctement les paramètres de coupe pour permettre au tissu d’intérêt d’être précisément coupé et délogé du tissu environnant sans brûler le bord de la zone sélectionnée. Ramification de l’ARN total avant amplification de l’ARN permet la détection de bandes électrophorétiques distinctes et des pics fluorescents de 18 et 28S sous-unités ribosomales dans des échantillons d’ARN de bonne qualité.
L’ARN antisens synthétisé avec succès montrera une distribution symétrique unimodale de taille de 100 à 1000 nucléotides avec un pic autour de 300 nucléotides après deux tours d’amplification. Le traçage à l’échelle multidimensionnelle des gènes exprimés dans les différents tissus au cours des 48 heures de germination illustre une plus grande similitude entre les échantillons d’un seul tissu qu’entre les échantillons du même point de temps, mais les tissus différents. Le nombre de gènes exprimés différemment augmente progressivement au cours de la germination dans chaque tissu par rapport au point de temps zéro heure du tissu.
Dans cette analyse représentative, 25% de plumule, 34% de radicle et 41% de gènes différentiels exprimés de scutellum se sont trouvés pour être exclusivement exprimés dans chaque tissu. Il est important d’ajuster correctement les paramètres de coupe pour une excision précise et le déloger la zone du sélecteur du tissu environnant sans brûler le bord de la région sélectionnée. Avec des méthodes améliorées de purification de la chromatine et des protéines, et d’améliorer l’instrument de spectrométrie de masse, LCM peut être utilisé pour le type de cellule spécifique implants épigénomiques et protéomiques études.
