Этот протокол использует лазерно-захват Microdissection в сочетании с РНК-sequencing для получения пространственных и временных транскриптомов из конкретных клеток в растениях интересов, используя небольшое количество биологических материалов. Основным преимуществом лазерной техники является то, что она облегчает прямую визуализацию клеток в рамках нормальной ткани, позволяя дискретным клеткам быть точно изолированными в бесконтактной манере. Хотя этот протокол оптимизирован для изоляции клеток растений, он может быть применен к большинству клеток, которые могут быть сто логически определены.
Хорошая подготовка образца имеет решающее значение. Таким образом, один выполнения этой техники в первый раз, опора оптимизации фиксации тканей и встраивания имеет важное значение до лазерного захвата microdissection. Перед сбором образца ткани подготовьте фиксатор, соответствующий видам и типу тканей, которые будут собраны.
Для семян ячменя, разрезать образцы семян пополам, прежде чем погрузить образцы, по крайней мере 10 X объем ледяной фиксатор. Используйте вакуумную инфильтрацию для ускорения проникновения фиксатора. Ткань должна утонуть к концу инфильтрации, затем обновить фиксатор для ночной инкубации и передать образцы в кассеты для обработки тканей.
Поместите загруженные ткани кассеты в металлическую корзину автоматического процессора и прикрепите металлическую корзину к ее держателю над камерой. Установите программу на панели управления процессора ткани и нажмите начать программу автоматической обработки. Система будет обезвоживать образцы, окунув кассеты в градиентную серию этанола в течение 90 минут на концентрацию, как указано.
После последнего погружения этанола, система будет погружать образцы в градиенты ксилена в течение 90 минут на раствор, как указано. Затем 290 минут погружения в расплавленный парафин при 55 до 60 градусов по Цельсию. На следующее утро, удалить парафин проникли кассеты из ткани процессора и приступить к парафин встраивания.
На следующее утро, использовать тонкие типсы для передачи образцов процесса в соответствующим размером формы и добавить расплавленный парафин над каждым образцом. Для семян ячменя, ориентировать образцы в парафин продольно в направлении резки для облегчения приобретения продольных секций. Поместите чистую кассету на форму и убедитесь, что вся кассета полностью покрыта достаточным объемом парафина, чтобы обеспечить образец кассеты.
Затем поместите плесень на холодную тарелку в течение 10 до 20 минут, пока парафин установлен перед выпуском блока из формы. Чтобы подготовить СЛАЙДЫ PEN Membrane, погрузим слайды в раствор ДЛЯ деактивации RNS в течение трех секунд, а затем два кратких моет и DEPC обработанной водой. Затем диск слайды в 370 градусов по Цельсию инкубатор, чтобы удалить остатки раствора и УФ лечения слайдов в шкафу ламинарного потока в течение 30 минут, чтобы повысить их парафин не фундук.
Для сечения образцов тканей поместите парафиновые блоки на холодную тарелку и заполните водяную баню водой, обработанной DEPC, затем прогремите до 42 градусов по Цельсию. Обрезка блоков на глубину области интереса и раздел парафин блоков до шести до 10 микрон толщиной. Хорошо секционый блок сформирует ленту на краю лезвия.
Используйте тонкий пинцет, чтобы аккуратно перенести ленты из микротома на водяную баню, заботясь о том, чтобы лента лежит на поверхности воды. Чтобы собрать секции, держа слайд под углом 45 градусов, используйте движение вверх, чтобы поднять ленту из воды на горку и использовать ткань, свободную от ворса, чтобы тщательно удалить избыток воды. Когда все разделы были собраны, мыть слайды с 320 секунд моет в ксилена следуют 230 секунд моет в 100% этанола и 230 секунд моет в 70% этанола.
Для микроразделить клетки, представляющие интерес из депаррафинизированных и сухих секций тканей, загрузите слайды на трех слотах LCM микроскопа и загрузите трубку сбора в доступные слоты. Переместите этап, чтобы найти область образца, который должен быть сокращен и вырезать пустой сегмент, свободный от ткани на мембранной слайде. Для оптимизации скорости резки и резки в лазерном давлении катапульты энергии и фокуса.
Используйте инструменты для рисования, чтобы наметить область интереса к ткани и использовать оптимизированные параметры и функцию Robo LPC для катапульты клеток в клеевые колпачки. Выберите флаг из списка элементов, чтобы использовать инструмент флага для разметки областей, представляющих интерес. Проверьте кнопку проверки крышки, чтобы проверить клей крышку, чтобы подтвердить, что образцы были захвачены.
Обычно для извлечения РНК требуется от 10 до 15 секций на крышку. Сразу же после того, как все образцы были приобретены, немедленно приступить к добыче РНК, чтобы избежать деградации РНК. После извлечения РНК и усиления РНК используйте автоматизированную систему электрофореза, в соответствии с инструкциями производителя для количественной оценки и квалификации антисенсе РНК.
В этом исследовании, LCM, РНК-секвенирование было применено к небольшому числу клеток из трех органов эмбриона, каждые восемь часов в течение 48-часового времени курса во время прорастания. Важно правильно настроить параметры резки, чтобы ткань, интересная, была точно вырезана и выбита из окружающей ткани без сжигания края выбранной области. Последствия общей РНК до усиления РНК позволяют обнаруживать различные электрофоретические полосы и флуоресцентные пики 18 и 28S рибосомных подразделений в образцах РНК хорошего качества.
Успешно синтезированная антисенсовая РНК будет работать unimodal симметричного распределения размеров от 100 до 1000 нуклеотидов с пиком около 300 нуклеотидов после двух раундов усиления. Многомерное построение генов, выраженных в различных тканях в течение 48 часов прорастания, иллюстрирует большее сходство между образцами одной ткани, чем между образцами из одной и той же точки времени, но разными тканями. Количество дифференциально выраженных генов постепенно увеличивается в течение прорастания в каждой ткани относительно нулевой часовой точки времени ткани.
В этом репрезентативном анализе было установлено, что 25% plumule, 34% радикула и 41% скутеллума дифференциально выраженных генов выражаются исключительно в каждой ткани. Важно правильно настроить параметры резки для точного иссечения и вытеснения области селектора из окружающей ткани без сжигания края выбранной области. С улучшенными методами хроматина и очищения белка, и повышения масс-спектрометрии инструмент, LCM может быть использован для клеточного типа конкретных эпигеномных и протеомических исследований имплантатов.
