هذه التقنية تسمح استجواب داخل الخلايا الحيوية مع دقة المكانية العالية للغاية وخصوصية الخلية باستخدام المجهر البصرية القياسية فقط. هذه الطريقة تسهل التحفيز والاستجواب الكهربائي للخلايا ومواقع محددة داخل الخلايا ويمكن أن يؤديها في المختبر وكذلك في 3D السابقين الاستعدادات الأنسجة. هذه التقنية تمكن من التحقيق الحيوي والإلكترونية من العديد من الساحات الخلوية مثل خلايا القلب أو الدماغ، فضلا عن الاتصالات الكهربائية بين جميع الخلايا غير مثير لدينا.
لعزل myofibroblasts من تعليق القلب العضلي الأروميبلاست ، قبل لوحة الخلايا المعزولة على طبق ثقافة الأنسجة 100 ملليمتر لمدة ساعة واحدة ، حيث تحتاج خلايا القلب إلى سطح ألياف عنقية وعلاجها للتمسك بها. في نهاية الحضانة، وجمع القلبية الغنية التي تحتوي على افرائب للثقافة المصب المشترك. شطف myofibroblasts مع DMEM للقضاء على أي cardiomyocytes المتبقية وتغذية الخلايا مع ثقافة جديدة المتوسطة قبل يومين إلى أربعة أيام إضافية من الحضانة.
عندما تصل الخلايا إلى 80٪التقاء، واستخدام كاتب الماس لقطع رقاقة ثلاثة في ثلاثة ملليمتر من رقاقة مع الأسلاك النانوية السيليكون ترسب البخار الكيميائية. واستخدام ملقط حادة لشطف رقائق في 70٪ الإيثانول. بعد الشطف، الهواء الجاف رقائق لمدة 30 دقيقة تحت الأشعة فوق البنفسجية في غطاء تدفق لارينار السلامة الحيوية، قبل نقل رقائق إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير معقمة.
استخدام خلية كاملة ثقافة المتوسطة شطف لإزالة أي الإيثانول المتبقية، قبل sonicating رقائق في ملليلتر واحد من ثقافة جديدة المتوسطة في حمام سونيكيشن لمدة دقيقة إلى 10 دقائق. يجب أن تتحول فائقة غائم كما يتم تحرير أسلاك نانو. مزيج تعليق أسلاك النانو السيليكون في خمسة ملليلتر من الثقافة الطازجة المتوسطة والبذور حل أسلاك نانو على طبق من myofibroblasts.
بعد أربع ساعات في حاضنة ثقافة الخلية ، شطف الطبق خمس مرات مع ثقافة جديدة المتوسطة لإزالة أي أسلاك نانوية غير متداخلة والاستمرار في احتضان الخلايا لمدة ساعة أخرى للسماح لأي أسلاك نانوية داخلية جزئيا ليتم دمجها تماما. أضف التالي 500 ميكرولترات من محلول طلاء الكولاجين الطازج إلى طبق قعر زجاجي عيار 35 ملليمتر. بعد حضانة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية، شطف الطبق مع برنامج تلفزيوني عقيم وحصاد الهجينة myofibroblast السيليكون نانوير، مع ثلاثة ملليلتر من التربسين، لمدة دقيقتين في 37 درجة مئوية.
عندما تكون الخلايا قد فصلت، ووقف رد فعل مع 10 ملليلتر من المتوسطة الثقافة، وشطف بقوة عن طريق الأنابيب وعدم الطرد المركزي أكثر من 200 G لتجنب إتلاف الخلايا. ثم إعادة تعليق الكريات الخلية الهجينة في ملليلتر واحد من المتوسطة الطازجة، وبذرة الخلايا على طبق القاع الزجاجي المغلفة الكولاجين. للتحقق من استيعاب أسلاك النانو ، قم بتسمية الخلايا بالخلايا الفلورية والأصباغ الغشاءية ، وفقًا للبروتوكولات القياسية ، واستخدام مجهر confocal لتصوير الخلايا.
كما أسلاك السيليكون النانوية هي عاكسة للغاية، يمكن استخدام الضوء المنعكوس بدلا من الفلوريسنس لتصورها. لإعداد myofibroblast السيليكون نانواير الهجين cardiomyocyte الثقافة المشتركة، بذور العدد المناسب من كل نوع الخلية على طبق أسفل الزجاج المغلفة الكولاجين. وتربية الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة، للسماح للخلايا لتشكيل تقاطعات الفجوة بين الخلايا.
في يوم التجربة، استبدل المستهتر في الثقافة بميليلتر واحد من الاستزراع المتوسط المُكمل بصبغة حسّاسة حديثة التحضير للكالسيوم، لاحتضان 20 إلى 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل لوحة مرتين مع برنامج تلفزيوني عقيمة، قبل علاج الخلايا مع ملليلتر واحد من قبل الدافئة الفينول الأحمر مجانا DMEM. ثم تسمح لصبغة الكالسيوم داخل الخلايا بالخضوع للاجتثاث لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، قبل الحصول على صور خط الأساس.
قبل التصوير البصري والتحفيز، سخني حاضنة صغيرة مرطبة على المجهر مع خط ليزر موحد مقرون بمسار الضوء، لتصوير الكالسيوم والتحفيز البصري إلى 37 درجة مئوية وخليط ثاني أكسيد الكربون في عصر الفقاعة بنسبة 5٪. عندما يكون المجهر جاهزاً، ضع myofibroblast الهجين cardiomyocyte ثقافة المشاركة في الحاضنة الصغيرة وتصور الأسلاك النانوية عن طريق المجهر حقل مشرق لتحديد موقع التحفيز المناسب. عندما تم تحديد موقع، إعادة تكوين مسار الضوء إلى وضع الفلوريسنس، مع الحفاظ على نقطة التحفيز في الموقع المحدد مسبقا من الأسلاك نانو، والتحقق من صحة قوة التحفيز الأمثل وطول النبض، لكل حجم أسلاك نانوية السيليكون ونوع الخلية.
الحصول على تسجيل 2-10 ثانية من نشاط الكالسيوم داخل الخلايا الأساسية، قبل تحفيز الأسلاك نانو مع نبضة ليزر واحد من واحد إلى 10 melowatts من السلطة ومدة 1-10 ميلي ثانية، وتسجيل موجة الكالسيوم الناتجة لمدة ثانية أخرى إلى 10 ثوان. في نهاية التجربة نقل الأفلام المسجلة من التحفيز البصري إلى برنامج مناسب، لتحليل إضافي. باستخدام البصريات القياسية على النقيض من المرحلة، يتم عرض خلايا الالتقاء بسهولة عن طريق المجهر الخفيف.
ومع ذلك، فإن أسلاك السيليكون النانوية بالكاد تكون مرئية، مما يجعل من المستحيل تحديد مواقعها بهذه الطريقة. سوبر فرض الصور الميدانية الخفيفة والداكنة، ومع ذلك، يسمح التصور من الترتيب النووي بيري من أسلاك السيليكون النانوية العاكسة الخفيفة. يمكن استخدام المجهر Confocal لتصور الفلورسنت علامة cytosol الملون وأغشية البلازما، مما يجعل الموقع داخل الخلايا من أسلاك السيليكون النانوية أكثر وضوحا.
باستخدام المجهر القياسية، يمكن الحصول على صورة حقل مشرق لتحديد موقع أسلاك السيليكون النانوية التي سيتم تحفيزها. ويمكن بعد ذلك الحصول على شريط فيديو خط أساس قصير من cardiomyocytes الضرب تلقائيا و myofibroblasts يستريح. بعد التحفيز، يمكن تسجيل انتشار الكالسيوم داخل الثقافة المشتركة.
يمكن تحديد الوقت الذي تصبح فيه الخلايا المختلفة متحمسًا من خلال النقطة التي يصل فيها التغير في متوسط التدفق البصري إلى الحد الأقصى. ويمكن بعد ذلك حساب التدفق البصري للمساعدة في تحديد وقت التنشيط داخل كل منطقة خلية. يمكن تحديد السرعات داخل الخلايا لكل خلية باستخدام الرسوم البيانية في الخيمة، مع ميل الخط الذي يمثل عكس سرعة الانتشار داخل الخلايا.
على سبيل المثال، هنا، يمكن ملاحظة ملخص للسرعات المختلفة بين الخلايا وفيما بينها قياس التفاعلات الخلية داخل ثقافة مشتركة واحدة. ويمكن استخدام هذه الطريقة في دراسات في الجسم الحي عن طريق حقن الهجينة السيليكون الخلية مباشرة في الأنسجة واستخدام 3D السابقين فيفو الاستعدادات لدراسة في شركة الكهربائية في.
