Bu teknik, sadece standart optik mikroskopi kullanarak son derece yüksek uzamsal çözünürlük ve hücre özgüllüğü ile hücre içi biyoelektrik sorgulama sağlar. Bu yöntem, hücrelerin ve hücrelerin belirli yerlerinin uyarılmasını ve elektriksel olarak sorgulanmasını kolaylaştırır ve invitro ve 3Boyutlu ekstrem doku preparatlarında da yapılabilir. Bu teknik, kalp veya beyin hücreleri gibi birçok hücresel arenanın biyo-elektronik incelemesinin yanı sıra tüm heyecansız hücrelerimiz arasındaki elektriksel iletişimi de sağlar.
Miyofibroblastkardiyomiyosit süspansiyonundan miyofibroblastları izole etmek için, kardiyomiyositlerin yapışması için fiber boyunlu ve tedavi edilmiş bir yüzeye ihtiyaç duydukları ndan, 100 milimetrelik doku kültür çanamındaki izole hücreleri bir saat önceden plakalayın. Kuluçka sonunda, downstream co-kültür için supernatant içeren zenginleştirilmiş kardiyomiyosit toplamak. Kalan kardiyomiyositleri ortadan kaldırmak ve iki ila dört günlük kuluçkadan önce hücreleri taze kültür ortamıyla beslemek için Miyofibroblastları DMEM ile yıkın.
Hücreler %80 birleştiğinde, kimyasal buhar birikimi nevruz lu silikon nanotelleriçeren bir gofretten üç milimetrelik bir çipi kesmek için elmas bir kâtip kullanın. Ve %70 etanolde talaşları durulamak için keskin forceps kullanın. Durulama sonra, steril bir mikro santrifüj tüpü ne çipleri aktarmadan önce, bir biyo-güvenlik laminar akış kaputunda ultraviyole ışık altında 30 dakika boyunca cips kuru.
Bir ila 10 dakika boyunca bir sonication banyotaze kültür orta bir mililitre cips sonicating önce, kalan etanol kaldırmak için tam bir hücre kültürü orta durulama kullanın. Nano kablolar serbest bırakılırken supernatant bulutlu dönecektir. Silikon nanofon süspansiyonu beş mililitre taze kültür ortamına karıştırın ve nano tel çözeltisini miyofibroblastların yemeğine tohumlayın.
Hücre kültürü kuluçka dört saat sonra, herhangi bir içselleştirilmiş nanowires kaldırmak için taze kültür ortamı ile çanak beş kez durulayın ve herhangi bir kısmen içselleştirilmiş nanowires tamamen dahil edilmesine izin vermek için başka bir saat için hücreleri kuluçkaya devam. Sonraki 35 milimetrecam alt çanak için taze hazırlanmış kollajen kaplama çözeltisi 500 mikrolitre ekleyin. 37 santigrat derece bir saat kuluçka sonra, steril PBS ile çanak durulayın ve Silikon nanowire miyofibroblast melez hasat, tripsin üç mililitre ile, 37 santigrat derece iki dakika için.
Hücreler ayrıldığında, 10 mililitre kültür ortamı ile reaksiyonu durdurun, pipetleme ile şiddetle durulanın ve hücrelere zarar vermemek için 200 G'nin üzerinde santrifüj etmeyin. Sonra taze orta bir mililitre hibrid hücre pelet yeniden askıya, ve kollajen kaplı cam alt çanak hücreleri tohum. Nano tel içselleştirmedoğrulamak için, standart protokollere göre floresan sitosol ve membran boyaları ile hücreleri etiketleyin ve hücreleri görüntülemek için bir konfokal mikroskop kullanın.
Silikon nanoteller son derece yansıtıcı olduğundan, yansıtılan ışık görselleştirme için floresan yerine kullanılabilir. Bir miyofibroblast silikon nanowire hibrid kardiyomiyosit co-kültür kurmak için, bir kollajen kaplı cam alt çanak üzerine her hücre tipinin uygun sayıda tohum. Ve 48 saat boyunca 37 derecedeki hücreleri kültürlendirin, böylece hücreler hücreler arası boşluk kavşaklarını oluşturabilesin.
Deney günü, kültür supernatant kültür supernatant kültür ortamı taze hazırlanmış kalsiyum duyarlı boya ile takviye ile değiştirin, 37 santigrat derecede 20 ila 30 dakikalık kuluçka için. Kuluçka sonunda, önceden ısıtılmış fenol kırmızı serbest DMEM bir mililitre ile hücreleri tedavi etmeden önce, steril PBS ile iki kez plaka yıkayın. Daha sonra hücre içi kalsiyum boyasının temel görüntüleri elde etmeden önce 37 santigrat derecede 30 dakika estersizleşmeye geçmesine izin verin.
Optik görüntüleme ve stimülasyondan önce, 37 santigrat dereceye kadar kalsiyum görüntüleme ve optik stimülasyon ve %5 kabarcık dönemi karbondioksit karışımı için ışık yoluna birleştirilmiş bir lazer hattı ile bir mikroskop üzerinde nemlendirilmiş mikro-kuluçka makinesi önceden ısıtın. Mikroskop hazır olduğunda, mikro inkübatör içine miyofibroblast hibrid kardiyomiyosit co-kültür yerleştirin ve uygun bir stimülasyon sitesi bulmak için parlak alan mikroskobu ile nanowires görselleştirmek. Bir site tespit edildiğinde, ışık yolunu floresan moduna yeniden yapılandırın, nano telin önceden tanımlanmış konumundaki stimülasyon noktasını korurken, ve her silikon nanowire boyutu ve hücre tipi için en uygun uyarım gücünü ve darbe uzunluğunu doğrulayın.
Nano teli 1 ila 10 melowatt güç ve 1 ila 10 milisaniyelik tek bir lazer darbesi ile uyarmadan önce, başlangıç noktası hücre içi kalsiyum aktivitesinin 2-10 saniyelik kaydını elde edin ve elde edilen kalsiyum dalgasını 2 ila 10 saniye daha kaydedin. Denemenin sonunda ek analiz için optik stimülasyonun kaydedilmiş filmlerini uygun yazılım programına aktarın. Standart faz kontrast optik kullanılarak, birleştiği hücreler ışık mikroskobu ile kolayca görüntülenebilir.
Silikon nanoteller, ancak, ancak görünür, konumlarını imkansız bu yöntemle tanımlamak için yapım. Ancak, Açık ve koyu alan görüntülerinin süper dayatma, ışık yansıtıcı silikon nanowires Perry nükleer düzenleme görselleştirme sağlar. Konfokal mikroskopi floresan marker lekeli sitosol ve plazma membranları görselleştirmek için kullanılabilir, silikon nanowires hücre içi konumu daha belirgin hale.
Standart mikroskopi kullanılarak, uyarılması gereken silikon nanofonun yerini belirlemek için parlak bir alan görüntüsü elde edilebilir. Spontan dayak kardiyomiyositler ve istirahat miyofibroblastlar kısa bir temel video daha sonra elde edilebilir. Stimülasyondan sonra, ortak kültür içinde kalsiyum yayılımı kaydedilebilir.
Farklı hücrelerin heyecanlandığı zaman, ortalama optik akıştaki değişimin maksimuma ulaştığı noktaya göre belirlenebilir. Optik akış daha sonra her hücre bölgesi içinde aktivasyon zamanının belirlenmesine yardımcı olmak için hesaplanabilir. Hücre içi hızlar khaimah grafikleri kullanılarak her hücre için belirlenebilir, hücre içi yayılma hızıters temsil eden çizginin eğimi ile.
Örneğin, burada, tek bir ortak kültür içindeki hücre etkileşimleri için ölçülen farklı hücre içi ve hücre içi hızların bir özeti görülebilir. Bu yöntem in vivo elektrik şirketi çalışma için hücre Silikon melezdoğrudan dokuya enjekte ve 3D ex vivo preparatları kullanarak in vivo çalışmalar için kullanılabilir.
