Cette technique permet l’interrogation bioélectrique intracellulaire avec la résolution spatiale extrêmement élevée et la spécificité cellulaire utilisant seulement la microscopie optique standard. Cette méthode facilite la stimulation et l’interrogation électrique des cellules et des emplacements spécifiques dans les cellules et peut être effectuée in vitro ainsi que dans les préparations tissulaires ex vivo 3D. Cette technique permet l’investigation bio-électronique de nombreuses arènes cellulaires telles que les cellules cardiaques ou cérébrales, ainsi que la communication électrique entre toutes nos cellules non excitables.
Pour isoler les myofibroblastes d’une suspension cardiomyocyte myofibroblaste, pré-plaque les cellules isolées sur un plat de culture tissulaire de 100 millimètres pendant une heure, car les cardiomyocytes ont besoin d’une fibre cousée et traitée surface pour adhérer. À la fin de l’incubation, recueillir le cardiomyocyte enrichi contenant du supernatant pour la co-culture en aval. Rincer les myofibroblastes avec du DMEM pour éliminer les cardiomyocytes restants et nourrir les cellules avec un milieu de culture frais avant deux à quatre jours supplémentaires d’incubation.
Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluent, utilisez un scribe de diamants pour couper une puce de trois par trois millimètres d’une gaufrette avec des nanofils de silicium cultivés par dépôt de vapeur chimique. Et utilisez des forceps tranchants pour rincer les copeaux dans 70% d’éthanol. Après le rinçage, sécher à l’air les copeaux pendant 30 minutes sous la lumière ultraviolette dans un capot d’écoulement laminaire bio-sécurité, avant de transférer les copeaux dans un tube stérile de micro centrifugeuse.
Utilisez un rinçage moyen de culture cellulaire complète pour éliminer tout éthanol restant, avant de sonner les copeaux dans un millilitre de milieu de culture frais dans un bain de sonication pendant une à 10 minutes. Le supernatant doit devenir trouble à mesure que les nanofils sont libérés. Mélanger la suspension nanofil de silicium en cinq millilitres de milieu de culture frais et ensemencer la solution nano filaire sur le plat des myofibroblastes.
Après quatre heures dans l’incubateur de culture cellulaire, rincer le plat cinq fois avec un milieu de culture frais pour enlever les nanofils non internalisés et continuer à couver les cellules pendant une autre heure pour permettre à tous les nanofils partiellement intériorisés d’être complètement incorporés. Ajouter ensuite 500 microlitres de solution de revêtement de collagène fraîchement préparée à un plat de fond en verre de 35 millimètres. Après une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius, rincer le plat avec pbs stérile et récolter les hybrides myofibroblaste nanofil silicon, avec trois millilitres de trypsine, pendant deux minutes à 37 degrés Celsius.
Lorsque les cellules se sont détachées, arrêter la réaction avec 10 millilitres de culture moyenne, rincer vigoureusement par pipetting et ne pas centrifuger plus de 200 G pour éviter d’endommager les cellules. Puis re-suspendre les granulés de cellules hybrides dans un millilitre de milieu frais, et les graines sur le collagène enrobé de verre plat de fond. Pour vérifier l’internalisation des nanofils, étiquetez les cellules avec des colorants fluorescents de cytosol et de membrane, selon les protocoles standard, et utilisez un microscope confocal pour l’image des cellules.
Comme les nanofils de silicium sont hautement réfléchissants, la lumière réfléchie peut être utilisée au lieu de la fluorescence pour leur visualisation. Pour mettre en place une co-culture de cardiomyocytes hybrides à nanofil de silicium myofibroblaste, ensemencer le nombre approprié de chaque type de cellule sur un plat de fond en verre enduit de collagène. Et la culture des cellules à 37 degrés Celsius pendant 48 heures, pour permettre aux cellules de former des jonctions intercellulaires écart.
Le jour de l’expérience, remplacer la culture supernatant par un millilitre de milieu de culture complété par du colorant sensible au calcium fraîchement préparé, pour une incubation de 20 à 30 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver la plaque deux fois avec du PBS stérile, avant de traiter les cellules avec un millilitre de DMEM sans phénol préchauffé. Ensuite, laissez le colorant intracellulaire de calcium subir la désestérification pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, avant d’acquérir des images de base.
Avant l’imagerie et la stimulation optiques, préchauffer un micro-incubateur humidifié au microscope avec une ligne laser collimée couplée dans le chemin lumineux, pour l’imagerie calcique et la stimulation optique à 37 degrés Celsius et un mélange de dioxyde de carbone de l’ère des bulles de 5 %. Lorsque le microscope est prêt, placez la co-culture cardiomyocyte hybride myofibroblaste dans le micro incubateur et visualisez les nanofils par microscopie de champ lumineux pour localiser un site de stimulation approprié. Lorsqu’un site a été identifié, reconfigurez le chemin lumineux vers le mode fluorescence, tout en maintenant le point de stimulation à l’emplacement prédéfini du nanofil, et validez la puissance de stimulation optimale et la longueur du pouls, pour chaque taille de nanofil de silicium et type de cellule.
Obtenez un enregistrement de deux à dix secondes de l’activité calcique intracellulaire de base, avant de stimuler le fil nano avec une seule impulsion laser de un à 10 melowatts de puissance et une durée de un à 10 millisecondes, enregistrant l’onde de calcium résultante pendant encore deux à 10 secondes. À la fin de l’expérience transférer les films enregistrés de la stimulation optique au logiciel approprié, pour une analyse supplémentaire. À l’aide de l’optique standard de contraste de phase, les cellules de confluence sont facilement visualisées par microscopie légère.
Les nanofils de silicium, cependant, sont à peine visibles, rendant leurs emplacements impossibles à définir par cette méthode. Super imposition d’images de champ clair et sombre, cependant, permet la visualisation de l’arrangement nucléaire Perry de la lumière réfléchissante nanofils de silicium. La microscopie confocale peut être utilisée pour visualiser le cytosol taché de marqueur fluorescent et les membranes plasmatiques, rendant l’emplacement intracellulaire des nanofils de silicium plus évident.
À l’aide d’une microscopie standard, une image de champ lumineux peut être obtenue pour identifier l’emplacement du nanofil de silicium à stimuler. Une courte vidéo de base des cardiomyocytes spontanément battants et des myofibroblastes de repos peut alors être acquise. Après stimulation, la propagation du calcium dans la co-culture peut être enregistrée.
Le moment auquel les différentes cellules s’excitent peut être déterminé par le moment où le changement de flux optique moyen atteint son maximum. Le flux optique peut ensuite être calculé pour faciliter l’identification du temps d’activation dans chaque région cellulaire. Les vitesses intracellulaires peuvent être déterminées pour chaque cellule à l’aide de graphiques Khaimah, la pente de la ligne représentant l’inverse de la vitesse de propagation intracellulaire.
Par exemple, ici, un résumé des différentes vitesses inter et intracellulaires mesurées pour les interactions cellulaires au sein d’une seule co-culture peut être observé. Cette méthode peut être utilisée pour des études in vivo en injectant les hybrides de silicium cellulaire directement dans le tissu et en utilisant des préparations 3D ex vivo pour étudier la société électrique in vivo.
