Esta técnica permite interrogatório bioelétrico intracelular com altíssima resolução espacial e especificidade celular usando apenas microscopia óptica padrão. Este método facilita a estimulação e interrogatório elétrico de células e locais específicos dentro das células e pode ser realizado in vitro, bem como em preparações de tecido ex vivo 3D. Essa técnica permite a investigação bioeletrônica de muitas arenas celulares, como células cardíacas ou cerebrais, bem como a comunicação elétrica entre todas as nossas células não excitáveis.
Para isolar os miofibroblasts de uma suspensão de cardiomiócito miofibroblast, pré-plaquetas as células isoladas em um prato de cultura tecidual de 100 milímetros por uma hora, como cardiomiócitos precisam de uma superfície de pescoço de fibra e tratada para aderir. No final da incubação, colete o cardiomiócito enriquecido contendo supernaciante para co-cultura a jusante. Enxágüe os myofibroblasts com DMEM para eliminar quaisquer cardiomiócitos restantes e alimente as células com meio de cultura fresco antes de dois a quatro dias adicionais de incubação.
Quando as células atingirem 80% de confluência, use um escriba de diamante para cortar um chip de três por três milímetros de um wafer com nanofios químicos de silício cultivados em vapor. E use fórceps afiados para enxaguar os chips em 70% de etanol. Depois de enxaguar, seque os chips por 30 minutos sob luz ultravioleta em um capô de fluxo laminar de biosegurança, antes de transferir os chips para um tubo de micro centrífuga estéril.
Use uma lavagem completa da cultura celular para remover qualquer etanol restante, antes de sonicar os chips em um mililitro de meio de cultura fresca em um banho de sônica por um a 10 minutos. O supernaspe deve ficar nublado à medida que os nano fios são liberados. Misture a suspensão do nanofio de silício em cinco mililitros de cultura fresca média e semente a solução de nano fio no prato de myofibroblasts.
Depois de quatro horas na incubadora de cultura celular, enxágue o prato cinco vezes com meio de cultura fresco para remover quaisquer nanofios não internizados e continuar a incubar as células por mais uma hora para permitir que quaisquer nanofios parcialmente internalizados sejam completamente incorporados. Em seguida, adicione 500 microliters de solução de revestimento de colágeno recém-preparada para um prato de fundo de vidro de 35 milímetros. Após uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius, enxágue o prato com PBS estéril e colher os híbridos de nanofio de silício myofibroblast, com três mililitros de trippsina, por dois minutos a 37 graus Celsius.
Quando as células se separarem, pare a reação com 10 mililitros de cultura média, enxágue vigorosamente por pipetação e não centrífuga acima de 200 G para evitar danificar as células. Em seguida, suspenda novamente as pelotas híbridas em um mililitro de meio fresco, e semee as células no prato de fundo de vidro revestido de colágeno. Para verificar a internalização do fio nano, rotule as células com citoso fluorescentes e corantes de membrana, de acordo com os protocolos padrão, e use um microscópio confocal para a imagem das células.
Como os nanofios de silício são altamente reflexivos, a luz refletida pode ser usada em vez de fluorescência para sua visualização. Para configurar uma co-cultura de cardiomioceto híbrido de nanofio de silício de silício, semeou o número apropriado de cada tipo de célula em um prato de fundo de vidro revestido de colágeno. E cultivar as células a 37 graus Celsius por 48 horas, para permitir que as células formem junções intercelulares.
No dia do experimento, substitua a supernasa cultura por um mililitro de cultura de meio suplementado com corante sensível ao cálcio recém-preparado, para uma incubação de 20 a 30 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, lave a placa duas vezes com PBS estéril, antes de tratar as células com um mililitro de DMEM livre de fenol pré-aquecido. Em seguida, permita que o corante de cálcio intracelular se submeta à desestreificação por 30 minutos a 37 graus Celsius, antes de adquirir imagens de linha de base.
Antes da imagem óptica e estimulação, pré-aqueça uma micro-incubadora umidificada em um microscópio com uma linha laser colidida acoplada no caminho da luz, para imagem de cálcio e estimulação óptica a 37 graus Celsius e uma mistura de dióxido de carbono da era da bolha de 5%. Quando o microscópio estiver pronto, coloque a co-cultura de cardiomiócito híbrido myofibroblast na micro incubadora e visualize os nanofios por microscopia de campo brilhante para localizar um local de estimulação apropriado. Quando um local for identificado, reconfigure o caminho da luz para o modo fluorescência, mantendo o ponto de estimulação na localização pré-definida do fio nano, e valide a potência de estimulação ideal e o comprimento do pulso, para cada tamanho de nanofio de silício e tipo de célula.
Adquira uma gravação de dois a dez segundos da atividade de cálcio intracelular da linha de base, antes de estimular o nano fio com um único pulso laser de um a 10 melowatts de potência e uma duração de um a 10 milissegundos, registrando a onda de cálcio resultante por mais dois a dez segundos. No final do experimento transferir os filmes gravados da estimulação óptica para o programa de software apropriado, para análise adicional. Usando óptica de contraste de fase padrão, as células de confluência são facilmente vistas por microscopia leve.
Os nanofios de silício, no entanto, são pouco visíveis, tornando suas localizações impossíveis de definir por este método. A super imposição de imagens de campo claro e escuro, no entanto, permite a visualização do arranjo nuclear perry dos nanofios de silício refletivos leves. A microscopia confocal pode ser usada para visualizar o marcador fluorescente manchado de citosol e membranas plasmáticas, tornando a localização intracelular dos nanofios de silício mais evidente.
Usando microscopia padrão, uma imagem de campo brilhante pode ser obtida para identificar a localização do nanofio de silício a ser estimulado. Um pequeno vídeo de linha de base dos cardiomiócitos espontaneamente batendo e os myofibroblasts descansando pode então ser adquirido. Após a estimulação, a propagação do cálcio dentro da cocultura pode ser registrada.
O momento em que as diferentes células ficam excitadas pode ser determinado pelo ponto em que a mudança no fluxo óptico médio atinge seu máximo. O fluxo óptico pode então ser calculado para auxiliar na identificação do tempo de ativação dentro de cada região celular. As velocidades intracelulares podem ser determinadas para cada célula usando gráficos khaimah, com a inclinação da linha representando o inverso da velocidade de propagação intracelular.
Por exemplo, aqui, pode ser observado um resumo das diferentes velocidades inter e intracelulares medidas para as interações celulares dentro de uma única cocultura. Este método pode ser utilizado para estudos in vivo injetando os híbridos de silício celular diretamente no tecido e usando preparações ex vivo 3D para estudar a empresa elétrica in vivo.
