이 기술은 표준 광학 현미경 검사법만을 사용하여 매우 높은 공간 해상도 및 세포 특이성을 가진 세포 내 생체 전기 적 심문을 허용합니다. 이 방법은 세포 내의 세포 및 특정 위치의 자극 및 전기 적 심문을 용이하게하고 3D 전 생체 조직 제제뿐만 아니라 시험관 내에서 수행 될 수있다. 이 기술은 심장 또는 뇌 세포와 같은 많은 세포 분야의 생체 전자 조사뿐만 아니라 우리의 모든 비 흥분 세포 사이의 전기 통신을 가능하게합니다.
근섬유아세포 심근세포 현탁액으로부터 근섬유아세포를 분리하기 위해 심근세포가 1시간 동안 100mm 조직 배양 접시에 분리된 세포를 미리 플레이트화하여 심근세포가 섬유목과 처리된 표면을 부착해야 하므로 부착한다. 인큐베이션의 끝에서, 다운스트림 공동 배양에 대한 상퍼를 포함하는 농축 된 심근세포이를 수집합니다. DMEM으로 심섬유 아세포를 헹구면 남은 심근세포를 제거하고 2~4일 의 추가 배양 전에 신선한 배양 배지로 세포를 공급합니다.
세포가 80%에 도달하면 다이아몬드 스크라이브를 사용하여 웨이퍼에서 3mm 칩을 화학 증기 증착 성 실리콘 나노와이어로 잘라냅니다. 그리고 70 %에탄올에 칩을 헹구기 위해 날카로운 집게를 사용합니다. 헹구고 바이오 안전 라미나르 플로우 후드에서 자외선 아래에서 30분 동안 칩을 공기 건조한 후 칩을 멸균 마이크로 원심분리기로 옮겨냅니다.
완전한 세포 배양 배지 헹구기를 사용하여 남은 에탄올을 제거한 후 초음파 욕조에서 신선한 배양 배지의 1 밀리리터로 칩을 초음파 처리합니다. 나노 와이어가 방출될 때 상체는 흐려져야 합니다. 실리콘 나노 와이어 서스펜션을 신선한 배양 배지의 5 밀리리터에 혼합하고 나노 와이어 용액을 심섬유 아세포의 접시에 시드하십시오.
세포 배양 인큐베이터에서 4시간 후, 신선한 배양 배지로 접시를 5회 헹구어 어떤 비내화 나노와이어를 제거하고 일부 내재된 나노와이어가 완전히 통합될 수 있도록 세포를 또 다른 시간 동안 배양한다. 다음으로 갓 준비된 콜라겐 코팅 용액 500마이크로리터를 35mm 유리 바닥 접시에 넣습니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 잠복한 후 멸균 PBS로 접시를 헹구고 실리콘 나노와이어 근섬유아세포 하이브리드를 수확하여 트립신 3밀리리터를 섭씨 37도에서 2분간 수확합니다.
세포가 분리되면 배양 배지의 10 밀리리터로 반응을 멈추고, 파이펫팅에 의해 적극적으로 헹구고 세포를 손상시키지 않도록 200G 이상 원심 분리하지 마십시오. 그런 다음 하이브리드 세포 펠릿을 신선한 배지의 1 밀리리터로 다시 중단하고 콜라겐 코팅 유리 바닥 접시에 세포를 시드합니다. 나노 와이어 내산화를 확인하려면 표준 프로토콜에 따라 형광 시토솔 및 멤브레인 염료로 세포를 라벨링하고 공초점 현미경을 사용하여 세포를 이미지화합니다.
실리콘 나노 와이어는 매우 반사, 반사 광 대신 그들의 시각화에 대 한 형광 을 사용할 수 있습니다. 심오섬유블라스트 실리콘 나노와이어 하이브리드 심근세포 공동배양을 설정하려면 각 세포 유형의 적절한 수를 콜라겐 코팅 유리 바닥 접시에 시드한다. 그리고 세포가 세포 간 간격 접합을 형성할 수 있도록 48 시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
실험 당일, 문화상수체를 갓 준비한 칼슘 에민감한 염료로 보충한 1밀리리터의 배양 배지로 대체하여 섭씨 37도에서 20~30분 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 미리 따뜻하게 페놀 레드 프리 DMEM의 1 밀리리터로 세포를 치료하기 전에, 멸균 PBS로 접시를 두 번 세척. 그런 다음 세포 내 칼슘 염료가 기준선 이미지를 획득하기 전에 섭씨 37도에서 30 분 동안 탈 에스테르화를 겪을 수 있도록하십시오.
광학 이미징 및 자극 전에, 컬리컬 레이저 라인과 현미경에 가습 된 마이크로 인큐베이터를 예열하여 광 경로에 결합되어 칼슘 이미징 및 광학 자극을 섭씨 37도및 5 % 버블 시대 이산화탄소 혼합물로 예열하십시오. 현미경이 준비되면, 심섬유 블라스트 하이브리드 심근 세포공동 배양을 마이크로 인큐베이터에 넣고 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 나노 와이어를 시각화하여 적절한 자극 부위를 찾습니다. 사이트가 확인되면, 나노 와이어의 미리 정의된 위치에서 자극 점을 유지하면서 형광 모드로 광 경로를 재구성하고, 각 실리콘 나노 와이어 크기와 셀 유형에 대해 최적의 자극 전력 및 펄스 길이를 검증한다.
기준선 세포내 칼슘 활성의 2-10초 기록을 획득하고, 1-10의 레이저 펄스와 1-10밀리초의 지속 시간으로 나노 와이어를 자극하여 생성된 칼슘 파를 2~10초 동안 기록한다. 실험이 끝나면 광학 자극의 녹화된 영화를 적절한 소프트웨어 프로그램으로 전송하여 추가 분석을 한다. 표준 상 대비 광학을 사용하여, 합류 세포는 빛 현미경 검사법에 의해 쉽게 볼 수 있습니다.
그러나 실리콘 나노와이어는 거의 보이지 않게 되어 이 방법으로 위치를 정의할 수 없습니다. 그러나 빛과 어두운 필드 이미지의 슈퍼 부과는 빛 반사 실리콘 나노 와이어의 페리 핵 배열의 시각화를 허용합니다. 공초점 현미경 검사는 형광 마커 염색 된 사이토솔 및 혈장 막을 시각화하는 데 사용할 수 있으며 실리콘 나노 와이어의 세포 내 위치를 보다 분명하게 만듭니다.
표준 현미경 검사를 사용하여 자극되는 실리콘 나노 와이어의 위치를 식별하기 위해 밝은 필드 이미지를 얻을 수 있습니다. 자발적으로 구타 심근 세포와 휴식 심근 세포의 짧은 기준 선 비디오는 다음 취득 할 수 있습니다. 자극 후, 공동 배양 내의 칼슘 전파를 기록할 수 있다.
다른 세포가 흥분되는 시간은 평균 광학 흐름의 변화가 최대치에 도달하는 지점에 의해 결정될 수 있습니다. 그런 다음 광학 흐름을 계산하여 각 세포 영역 내에서 활성화 시간을 식별하는 데 도움이 됩니다. 세포 내 속도는 카이마 그래프를 사용하여 각 세포에 대해 결정될 수 있으며, 세포 내 전파 속도의 반전을 나타내는 선의 경사와 함께 결정될 수 있다.
예를 들어, 여기서, 단일 공동 배양 내의 세포 상호 작용을 위해 측정된 상이한 세포 내 및 세포 내 속도에 대한 요약을 관찰할 수 있다. 이러한 방법은 세포 실리콘 하이브리드를 조직에 직접 주입하고 3D 전 생체 내 제제를 사용하여 생체 내 전기 회사를 연구함으로써 생체 내 연구를 위해 활용할 수 있다.
