البروتوكول الموصوف هنا يجعل من الممكن تحديد الظروف التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على الثبات البكتيري بطريقة عالية الإنتاجية. هذه الطريقة قابلة للتكيف بسهولة مع الشاشة لمختلف المجالات ، مثل لوحات المخدرات ومكتبات الجينات وأكثر من ذلك. وبما أن الطريقة تتضمن خطوات فرعية مختلفة، والتي سيتم إجراؤها في وقت واحد، يمكن أن تساعد العروض البصرية الباحثين على إدارة توقيتهم للحصول على نتائج دقيقة.
ابدأ بإعداد ثقافات الخلايا المجهرية. نقل 250 ميكرولتر من خلايا المرحلة الأسية إلى 25 ملليلتر من المتوسط LB المعدلة الطازجة في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر. ثم خلط بلطف تعليق الخلية لجعلها متجانسة.
نقل تعليق الخلية المخففة إلى خزان معقم 50 ملليلتر. باستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 150 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة microarray تحتوي على مواد كيميائية مختلفة. يمكن أيضا إنشاء Microarrays يدويا باتباع الطريقة الموضحة في المخطوطة النصية.
قم بتغطية لوحة microarray بغشاء سقف نفاذي للغاز واحتضانه في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية و250 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. لجعل لوحات الفحص المستمر، وإعداد 25 ملليلتر من المتوسط LB المعدلة التي تحتوي على خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من Ofloxacin في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر ونقل هذا المتوسط إلى خزان معقم. نقل 190 ميكرولتر من المتوسط LB المعدلة في كل بئر من لوحة عامة مسطحة أسفل 96 بئر.
بعد الحضانة على مدار 24 ساعة ، قم بإزالة microarray من شاكر ونقل 10 ميكرولترات من ثقافات الخلايا من microarray إلى آبار لوحة الفحص المستمر التي تحتوي على متوسط LB معدل مع Ofloxacin. خذ 10 ميكرولترات من تعليق الخلايا من لوحة المقال المستمر وتمييعها بشكل متسلسل ثلاث مرات في 290 ميكرولتر من محلول PBS باستخدام لوحة بئر مستديرة أسفل 96 وماصة متعددة القنوات. ثم بقعة 10 ميكرولتر من جميع تعليق الخلايا المخففة تسلسليا على لوحات أجار الطازجة خالية من المضادات الحيوية.
قم بتغطية لوحة الفحص المستمرة بغشاء سقف نفاذي للغاز واحتضانه في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية و250 دورة في الدقيقة لمدة ست ساعات. بعد الحضانة لمدة ست ساعات ، كرر التخفيف التسلسلي واكتشاف على لوحات أجار. احتضان لوحات أجار لمدة 16 ساعة في 37 درجة مئوية.
ثم عد مستعمرة تشكيل وحدات أو CFUs. استخدم مستويات CFU قبل وبعد ست ساعات من العلاج بالمضادات الحيوية لحساب الكسر المستمر في كل بئر. كما يساعد تعداد CFU قبل علاج OFX في تقييم آثار الأوسموليت على قابلية الإشريكية القولونية للاستمرار.
نقل 250 ميكرولتر من خلايا المرحلة الأسية إلى 25 ملليلتر من المتوسط LB المعدلة الطازجة التي تحتوي على التناضح التي تم تحديدها من الفحص microarray. احتضان القارورة في شاكر المدارية في 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة، قم بإزالة القارورة من شاكر ونقل 250 ميكرولتر من ثقافة الخلية إلى 25 ملليلتر من متوسط LB المعدل الطازج في قارورة محيرة 250 ملليلتر.
إضافة 25 ميكرولتر من محلول الأسهم Ofloxacin لتعليق الخلية ويهز قارورة بلطف لجعل ثقافة المقايسة متجانسة. احتضان القارورة في شاكر في 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة. في كل ساعة أثناء العلاج، بما في ذلك نقطة زمنية قبل إضافة Ofloxacin، نقل ملليلتر واحد من ثقافة المقايسة من القارورة إلى أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر وطارد مركزي في 17،000 مرة G لمدة ثلاث دقائق.
إزالة 950 ميكرولتر من supernatant وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 950 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل النهائي، إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من محلول PBS. خذ 10 ميكرولترات من تعليق الخلية وتمييعها بشكل متسلسل ست مرات مع 90 ميكرولتر من PBS داخل لوحة قاع مستديرة 96 جيدا.
بقعة 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا المخففة على لوحة أجار خالية من المضادات الحيوية. لزيادة الحد الأقصى للكشف، لوحة المتبقية 90 ميكرولتر من تعليق الخلية على لوحة أجار الطازجة. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة، ثم عد CFUs.
تظهر هنا صورة تمثيلية لألواح أجار المستخدمة لتحديد مستويات CFU من ثقافات الخلايا قبل وبعد علاج OFX. العمود الأول هو مجموعة التحكم. ويحتوي العمود الثاني على خلايا تم استزراعها في 100 ملليمولار من نترات الصوديوم ويحتوي العمود الثالث على خلايا تم استزراعها في 60 نترات صوديوم ملليمولار.
للبساطة ، يركز اثنان فقط من الأوسموليت هنا. يتم عرض تمثيل رسومي لبيانات CFU من اللوحات والكسور المستمرة من ثقافات الخلايا التي تم اختبارها في 96 لوحة بئر هنا. لحساب الكسور، تم تطبيع العد المستمر لأعداد الخلايا التي تم الحصول عليها قبل العلاج بالمضادات الحيوية.
لتوليد منحنيات قتل الطوري، تم استزراع الخلايا في 25 ملليلتر من المتوسط LB المعدلة مع osmolites المشار إليها وقوارير حائرة لمدة 24 ساعة، ثم نقلها إلى قوارير المقايسة استمرت للتعداد المستمر. عند محاولة هذا البروتوكول، ضع في اعتبارك أن اكتشاف الخلايا على لوحة أجار هو عمل مكثف ويتطلب التركيز. يمكن أن يؤدي الخطأ أثناء الخطوة إلى تلوث متقاطع بين الحالات التي يتم اختبارها.
لذلك من المهم ممارسة اكتشاف عينات متعددة في وقت واحد قبل التجربة. بعد هذا البروتوكول، يمكن فحص لوحات المخدرات ومكتبات الخلايا المتحولة لدراسة الآثار على المثابرة. مع هذا الفحص، حددنا عددا من حالات التناضح وال PS التي لها تأثير كبير على الثبات البكتيري.
