Criblage à haut débit des composés chimiques pour élucider leurs effets sur la persistance bactérienne

Résumé

Dans ce document de méthode, nous présentons une stratégie de criblage à haut débit pour identifier les composés chimiques, tels que les osmolytes, qui ont un impact significatif sur la persistance bactérienne.

Résumé

Les bactéries persistantes sont définies comme une petite sous-population de variantes phénotypiques ayant la capacité de tolérer des concentrations élevées d’antibiotiques. Ils constituent un problème de santé important, car ils ont été associés à des infections chroniques récurrentes. Bien que la dynamique stochastique et déterministe des mécanismes liés au stress soit connue pour jouer un rôle significatif dans la persistance, les mécanismes sous-jacents au passage phénotypique à/de l’état de persistance ne sont pas complètement compris. Bien que les facteurs de persistance déclenchés par les signaux environnementaux (p. ex. épuisement des sources de carbone, d’azote et d’oxygène) aient fait l’objet d’études approfondies, les effets des osmolytes sur la persistance n’ont pas encore été déterminés. À l’aide de puces à ADN (c.-à-d. 96 plaques de puits contenant divers produits chimiques), nous avons conçu une approche pour élucider les effets de divers osmolytes sur la persistance d’Escherichia coli de manière à haut débit. Cette approche est transformatrice car elle peut être facilement adaptée à d’autres réseaux de dépistage, tels que les panels de médicaments et les bibliothèques de gènes knock-out.

Introduction

Les cultures bactériennes contiennent une petite sous-population de cellules persistantes qui sont temporairement tolérantes à des niveaux anormalement élevés d’antibiotiques. Les cellules persistantes sont génétiquement identiques à leurs parents sensibles aux antibiotiques, et leur survie a été attribuée à l’inhibition transitoire de la croissance^1. Les cellules persistantes ont été découvertes pour la première fois par Gladys Hobby^2, mais le terme a été utilisé pour la première fois par Joseph Bigger lorsqu’il les a identifiées dans des cultures de Staphylococcus pyogenes traitées à la pénicilline^3. Une étude séminale publiée par Balaban et al.⁴ a découvert deux types de persister : les variantes de type I qui sont principalement formées par le passage à travers la phase stationnaire, et les variantes de type II qui sont continuellement générées pendant la croissance exponentielle. Les persistants sont détectés par des tests de survie clonogènes, dans lesquels des échantillons de culture sont prélevés à divers intervalles pendant les traitements antibiotiques, lavés et plaqués sur un milieu de croissance typique pour compter les cellules survivantes qui peuvent coloniser en l’absence d’antibiotiques. L’existence de persisters dans une culture cellulaire est évaluée par une courbe de mise à mort biphasique^4,5 où la décroissance exponentielle initiale indique la mort des cellules sensibles aux antibiotiques. Cependant, la tendance à tuer diminue au fil du temps, conduisant éventuellement à une région de plateau qui représente les cellules persistantes survivantes.

Les cellules persistantes ont été associées à diverses maladies telles que la tuberculose^6,la mucoviscidose^7,la candidose⁸ et les infections des voies urinaires^9. Presque tous les micro-organismes testés jusqu’à présent se sont avérés pour générer des phénotypes persistants, y compris mycobacterium tuberculosishautement pathogène^6, Staphylococcus aureus^10, Pseudomonas aeruginosa⁷ et Candida albicans^8. Des études récentes fournissent également des preuves de l’augmentation des mutants multirésistants dans les sous-populations persistantes^11,12. Des efforts considérables dans ce domaine ont révélé que les mécanismes de persistance sont très complexes et divers; des facteurs stochastiques et déterministes associés à la réponse SOS^13,14,aux espèces réactives de l’oxygène (ROS)^15,aux systèmes toxine/antitoxine (TA)^16,à l’autophagie ou à l’auto-digestion¹⁷ et à la réponse stricte liée au ppGpp¹⁸ sont connus pour faciliter la formation de persister.

Malgré des progrès significatifs dans la compréhension du phénotype de persistance, les effets des osmolytes sur la persistance bactérienne n’ont pas été entièrement compris. Étant donné que le maintien d’une pression osmotique optimale est une nécessité pour la croissance, le bon fonctionnement et la survie des cellules, une étude approfondie des osmolytes pourrait conduire à des cibles potentielles pour les stratégies anti-persister. Bien que laborieux, le criblage à haut débit est une approche très efficace pour identifier les métabolites et autres produits chimiques qui jouent un rôle crucial dans le phénotype de persistance^19,20. Dans ce travail, nous discuterons de notre méthode publiée¹⁹, où nous avons utilisé des puces à ADN, c’est-à-dire 96 plaques de puits contenant divers osmolytes (par exemple, chlorure de sodium, urée, nitrite de sodium, nitrate de sodium, chlorure de potassium), pour identifier les osmolytes qui influencent considérablement la persistance de E. coli.