Протокол, описанный здесь, позволяет идентифицировать условия, которые могут значительно повлиять на бактериальную персистенцию с высокой пропускной способностью. Этот метод легко адаптируется для скрининга для различных областей, таких как панели лекарств, библиотеки генов и многое другое. Поскольку метод включает в себя различные поду этапы, которые должны проводиться одновременно, визуальная демонстрация может помочь исследователям управлять своим временем для получения точных результатов.
Начните с подготовки культур клеток микрочипов. Перенесите 250 микролитров экспоненциальных фазовых ячеек в 25 миллилитров свежей модифицированной среды LB в 50-миллилитровой центрифужной трубке. Затем аккуратно перемешайте клеточную суспензию, чтобы сделать ее однородной.
Переложите разбавленный клеточный суспензию в стерильный резервуар объемом 50 миллилитров. Используя многоканальный пипетку, перенесите 150 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку пластины микрочипа, содержащей различные химические вещества. Микрочипы также могут быть сгенерированы вручную по методу, описанию в текстовой рукописи.
Накройте пластину микрочипов газопроницаемой потолочной мембраной и инкубирует ее в орбитальном шейкере при 37 градусах Цельсия и 250 оборотах в минуту в течение 24 часов. Чтобы сделать пластины для анализа персистенции, подготовьте 25 миллилитров модифицированной среды LB, содержащей пять микрограммов на миллилитр офлоксацина в 50-миллилитрной центрифужной трубке, и перенесите эту среду в стерильный резервуар. Перенесите 190 микролитров модифицированной среды LB в каждую скважину общей пластины с плоским дном 96 скважин.
После 24-часовой инкубации извлекают микрочип из шейкера и переносят 10 микролитров клеточных культур из микрочипы в лунки пластины для анализа персистента, содержащей модифицированную среду LB с офлоксацином. Возьмите 10 микролитров клеточной суспензии с пластины эссе и последовательно разбавьте ее три раза в 290 микролитрах раствора PBS, используя пластину с круглым дном 96 скважин и многоканальной пипетки. Затем найдите 10 микролитров всех последовательно разбавленных клеточных суспензий на свежих агаровых пластинах без антибиотиков.
Накройте пластину для анализа персистера газопроницаемой потолочной мембраной и инкубируете ее в орбитальном шейкере при 37 градусах Цельсия и 250 оборотах в минуту в течение шести часов. После шестичасовой инкубации повторите серийное разведение и пятнистость на агаровых пластинах. Инкубировать агариные пластины в течение 16 часов при 37 градусах Цельсия.
Затем подсчитайте колониеобразующие единицы или КОЕ. Используйте уровни КОЕ до и через шесть часов после лечения антибиотиками, чтобы рассчитать персистентную фракцию в каждой скважине. Количество КОЕ перед лечением OFX также помогает оценить влияние осмолитов на жизнеспособность e coli.
Перенесите 250 микролитров экспоненциальных фазовых ячеек в 25 миллилитров свежей модифицированной среды LB, содержащей осмолит, идентифицированный в результате скрининга микрочипов. Высиживание колбы в орбитальном шейкере при 250 об/мин и 37 градусах Цельсия в течение 24 часов. Через 24 часа извлеките колбу из шейкера и переложите 250 микролитров клеточной культуры на 25 миллилитров свежей модифицированной среды LB в 250-миллилитровой перегородке.
Добавьте 25 микролитров раствора офлоксацина в клеточную суспензию и аккуратно встряхните колбу, чтобы сделать культуру анализа однородной. Высиживание колбы в шейкере при 37 градусах Цельсия и 250 об/мин. Каждый час во время лечения, включая момент времени перед добавлением Офлоксацина, переносят один миллилитр культуры анализа из колбы в 1,5-миллилитрную микроцентрифужную трубку и центрифугируют ее в 17 000 раз G в течение трех минут.
Удалите 950 микролитров супернатанта и трижды промыте клетки 950 микролитрами PBS. После окончательной промывки повторно суспендируют ячейку гранулы в 100 микролитрах раствора PBS. Возьмите 10 микролитров клеточной суспензии и последовательно разбавьте ее шесть раз 90 микролитрами PBS внутри пластины с круглым дном из 96 скважин.
Надените 10 микролитров разбавленной клеточной суспензии на пластину без антибиотика. Чтобы увеличить предел обнаружения, наклеиваем оставшиеся 90 микролитров клеточной суспензии на свежую агаровую пластину. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия в течение 16 часов, затем считать КОЕ.
Здесь показано репрезентативное изображение агаровых пластин, используемых для определения уровней КОЕ клеточных культур до и после обработки OFX. Первый столбец является контрольной группой. Вторая колонка содержит клетки, которые были культивированы в 100 миллимолярных нитратах натрия, а третья колонка содержит клетки, которые культивировались в 60 миллимолярных нитратах натрия.
Для простоты здесь сосредоточены только два осмолита. Здесь показано графическое представление данных КОЕ с пластин и персистентных фракций клеточных культур, протестированных в 96 пластинах скважин. Для расчета фракций количество персистаторов нормализовали количество клеток, полученных до лечения антибиотиками.
Для получения пофазных кривых уничтожения клетки культивировали в 25 миллилитрах модифицированной среды LB с указанными осмолитами и сбитыми с толку колбами в течение 24 часов, а затем переносили в колбы для персистентного анализа для перечисления персистентов. При попытке этого протокола имейте в виду, что обнаружение клеток на агаровой пластине является трудоемким и требует фокусировки. Ошибка во время этапа может привести к перекрестному загрязнению среди тестируемых условий.
Поэтому важно практиковать обнаружение нескольких образцов одновременно перед экспериментом. Следуя этому протоколу, панели лекарств и библиотеки мутантных клеток могут быть проверены для изучения воздействия на персистенцию. С помощью этого скрининга мы выявили ряд осмолитов и состояний PS, которые оказывают значительное влияние на бактериальную персистенцию.
