O protocolo aqui descrito permite identificar condições que podem impactar significativamente a persistência bacteriana de forma de alto rendimento. Este método é prontamente adaptável à tela para várias áreas, como painéis de drogas, bibliotecas genéticas e muito mais. Como o método inclui várias sub etapas, que devem ser conduzidas simultaneamente, a demonstração visual pode ajudar os pesquisadores a gerenciar seu tempo para obter resultados precisos.
Comece preparando culturas de células de microarray. Transfira 250 microliters de células de fase exponencial para 25 mililitros de meio LB modificado fresco em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, misture suavemente a suspensão da célula para torná-la homogênea.
Transfira a suspensão da célula diluída para um reservatório estéril de 50 mililitros. Usando uma pipeta multicanal, transfira 150 microliters da suspensão celular para cada poço de uma placa de microarray contendo vários produtos químicos. Microarrays também podem ser gerados manualmente seguindo o método descrito no manuscrito do texto.
Cubra a placa de microarray com uma membrana de teto permeável a gás e incuba-a em um agitador orbital a 37 graus Celsius e 250 RPM por 24 horas. Para fazer placas de ensaio persister, prepare 25 mililitros de meio LB modificado contendo cinco microgramas por mililitro de Ofloxacina em um tubo centrífuga de 50 mililitros e transfira este meio para um reservatório estéril. Transfira 190 microliters do meio LB modificado para cada poço de uma placa de fundo plana genérica 96.
Após a incubação de 24 horas, remova a microarray do agitador e transfira 10 microlitadores de culturas celulares da microarray para os poços da placa de ensaio persistente contendo meio LB modificado com Ofloxacina. Pegue 10 microliters de suspensões celulares da placa de ensaio persister e dilua-a em série três vezes em 290 microliters de solução PBS usando uma placa de poço fundo redondo 96 e uma pipeta multicanal. Em seguida, local 10 microliters de todas as suspensões celulares diluídas em série em placas de ágar frescos sem antibióticos.
Cubra a placa de ensaio persistente com uma membrana de teto permeável a gás e incuba-a em um agitador orbital a 37 graus Celsius e 250 RPM por seis horas. Após a incubação de seis horas, repita a diluição serial e manchas em placas de ágar. Incubar as placas de ágar por 16 horas a 37 graus Celsius.
Em seguida, conte as unidades formadoras da colônia ou CFUs. Use os níveis de UFC antes e seis horas após o tratamento com antibióticos para calcular a fração persistência em cada poço. A CFU conta antes do tratamento OFX também ajudar a avaliar os efeitos dos osmolitos na viabilidade e coli.
Transfira 250 microliters de células de fase exponencial para 25 mililitros de meio LB modificado fresco contendo o osmolito identificado a partir da triagem de microarray. Incubar o frasco em um agitador orbital a 250 RPM e 37 graus Celsius por 24 horas. Após 24 horas, remova o frasco do agitador e transfira 250 microliters da cultura celular para 25 mililitros de meio LB modificado fresco em um frasco perplexo de 250 mililitros.
Adicione 25 microliters de solução de estoque de Ofloxacina à suspensão celular e agite o frasco suavemente para tornar a cultura do ensaio homogênea. Incubar o frasco em um shaker a 37 graus Celsius e 250 RPM. A cada hora durante o tratamento, incluindo um ponto de tempo antes da adição de Ofloxacin, transfira um mililitro da cultura de ensaio do frasco para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro e centrifuá-lo a 17.000 vezes G por três minutos.
Remova 950 microliters de supernascer e lave as células três vezes com 950 microliters de PBS. Após a lavagem final, suspenda a pelota de célula em 100 microliters de solução PBS. Pegue 10 microliters da suspensão celular e dilui-a em série seis vezes com 90 microliters de PBS dentro de uma placa inferior bem redonda de 96.
Local 10 microliters das suspensões de células diluídas em uma placa de ágar livre de antibióticos. Para aumentar o limite de detecção, aplaque os 90 microliters restantes de suspensão celular em uma placa de ágar fresca. Incubar as placas a 37 graus Celsius durante 16 horas, depois contar CFUs.
Uma imagem representativa das placas de ágar usada para determinar os níveis de CFU das culturas celulares antes e depois do tratamento OFX é mostrada aqui. A primeira coluna é o grupo de controle. A segunda coluna tem células que foram cultivadas em nitrato de sódio de 100 milimônios e a terceira coluna contém células que foram cultivadas em 60 milimilas de nitrato de sódio.
Para simplificar, apenas dois osmólitos estão focados aqui. Uma representação gráfica dos dados da UFC a partir das placas e frações persisteras das culturas celulares testadas em 96 placas de poço são mostradas aqui. Para calcular as frações, as contagens persisteres foram normalizadas para a contagem celular obtida antes do tratamento com antibióticos.
Para gerar curvas de morte porfásicas, as células foram cultivadas em 25 mililitros de meio LB modificado com os osmolitos indicados e frascos perplexos por 24 horas, depois transferidos para frascos de ensaio persistente para enumeração persistente. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que detectar as células na placa de ágar é trabalhoso e requer foco. Um erro durante a etapa pode levar à contaminação cruzada entre as condições que estão sendo testadas.
Por isso, é importante praticar a 800 mlyetos simultaneamente antes do experimento. Seguindo este protocolo, painéis de drogas e bibliotecas de células mutantes podem ser examinados para estudar os impactos na persistência. Com essa triagem, identificamos uma série de osmolitos e condições de PS que têm um impacto significativo na persistência bacteriana.
